集成化在线样品预处理装置及其应用制造方法及图纸

一种集成化在线样品预处理装置，其特征在于：即将酶反应器、固相萃取柱与液相色谱‑质谱系统在线联用，构建集酶水解‑固相萃取富集‑液相色谱‑质谱分离分析的一体化样品预处理分析平台系统，具体包括一级切换阀，二级切换阀，连接在两级切换阀之间的酶反应器，连接在一级切换阀上的定量环和固相萃取柱Ⅰ，连接在二级切换阀上的固相萃取柱Ⅱ和分离柱及质谱仪。将本发明专利技术的预处理装置应用于烟气代谢物分析检测，可实现目标化合物在线高效水解，并集多种SPE富集净化一体，富集倍数高，重现性好，为实现复杂基质样品中烟气代谢物的高灵敏、高通量分析研究提供了重要的技术支撑。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种样品在线预处理装置，即将固定化酶反应器、离子交换柱、固相萃取柱与液相色谱-质谱系统在线联用，构建集酶水解-固相萃取富集-液相色谱-质谱分离分析的一体化样品预处理分析平台系统。利用该装置可提高体液内烟气代谢物的分析检测的速度。
技术介绍
恶性肿瘤由于具有死亡率高、发病率高等特点，是威胁人类健康的病魔之一，已成为各科学研究领域关注的热点之一。 肺癌作为一种常见的恶性肿瘤， 其死亡率居各种恶性肿瘤的首位， 并且发病率呈明显上升趋势， 有研究报道 90%的肺癌相关死亡与吸烟行为密切相关[1]。吸烟诱发肺癌的一个重要影响因素是吸烟过程中产生的有害物质在体内的代谢产物具有强致癌性[2-3]。因此，检测体内烟气成分代谢标志物对系统研究其在体内的代谢机制，揭示不同烟气有害成分对人体健康的危害具有非常重要的意义。以尼古丁与 4-甲基亚硝胺-1-（3-吡啶）-1-丁酮（NNK）为例，两者是烟草制品中非常重要的两类化合物。尼古丁是烟草植物及其制品中含量最丰富的生物碱，约占总生物碱含量的 98%，吸烟成瘾与其密不可分。它在体内半衰期较短（约 2h），约70-80%被代谢成可天宁，并相继产生可天宁衍生的代谢产物，因此，可天宁是评价吸烟剂量及暴露环境烟气量的生物标记物[4]。NNK是尼古丁亚硝基化或微量烟碱亚硝基化形成的一种烟气致癌物，其在细胞色素 P450酶和谷胱甘肽转硫酶调控下的体内代谢产物 4-甲基亚硝胺基-1-（3-吡啶）-1-丁醇（NNAL）及其糖苷态衍生物（NNAL-Glucs）是研究NNK在人体内代谢过程中致毒与解毒机制非常有价值的接触生物标志物。游离 NNAL及NNAL-Glucs的含量总和与游离态 NNAL含量的比值可用于评估与 NNK 有关的癌症发生的风险[5]。然而，在烟气暴露者体液中，可天宁及其代谢产物的浓度通常在 ng/mL 数量级，NNAL及NNAL-Glucs一般在 pg/mL 级别；体液样品的复杂程度较高，检测受到基质严重干扰。目前，游离可天宁与 NNAL 分析通常包括两个基本步骤：（1）液液萃取或固相萃取等前处理技术对样品进行富集纯化；（2）基于气相色谱（GC）或液相色谱（LC）分离与热能分析（TEA）或串联质谱（MS/MS）联用的技术进行分析检测。在当前的研究中，总可天宁和 NNAL 的分析需要在富集净化步骤前首先将其糖苷衍生物进行去糖基化，从而得到游离的可天宁与 NNAL。该过程可以通过酸碱水解或酶水解等方式进行，其中通过 β-葡萄糖醛酸酶水解的方式应用较多。这种传统的水解反应存在耗时较长（16-24h），水解效率较低等缺点。除此之外，虽然目前常采用的方法较 Carmella 等人最早开发的经典方法[6]相对简单，无需多次提取和纯化等步骤，但是现有技术中代谢物的水解与富集过程依然需要离线操作，在分离分析检测之前仍需要进行真空浓缩、重溶等过程，多步样品处理容易造成样品损失污染，并且操作繁琐、耗时较长，严重阻碍了烟气代谢物的高灵敏和高通量分析。另外，总可天宁与总 NNAL 浓度动态范围宽，在体液内含量差异达 3-4个数量级，也难以实现同时分析[7]。因此，为了解决现有分析技术检测体液中总可天宁及总 NNAL 等代谢标记物方面存在的问题，发展集成化在线样品预处理技术有望为可天宁、NNAL 等多种烟气代谢标记物高灵敏、高通量分析研究提供重要技术支撑。固定化酶反应器（IMER）使酶在较长时间内可以反复使用，不仅酶的稳定性提高，而且易与底物和产物分开，水解效率增加，水解时间显著缩短。袁等[8]通过制备有机-硅胶杂化整体柱基质的胰蛋白酶反应器，将蛋白质水解时间缩短到2.5 分钟，大大提高了水解效率， 并将其成功与阳离子交换-反相二维液相色谱质谱在线联用，为实现大分子的高通量分离分析提供了必要条件。基于固相萃取（SPE）的样品富集方法与液液萃取技术相比，具有回收率高、富集倍数高，重现性好的特点，最重要的是容易实现在线、自动化和样品的批量处理。多种固相萃取技术，如混合型阳离子交换（MCX）、C18、分子印迹（MIP）等技术的发展，为实现烟气代谢物的高效富集与高灵敏分析奠定了基础。 将固相萃取技术与液相色谱质谱在线联用的分析策略能够显著减少分析时间，提高分析通量[9-10]。但是将固定化酶反应器用于目标化合物在线高效水解，并集多种SPE富集净化一体，与液相色谱-质谱分析结合的集成化技术用于体液等复杂基质样品中烟气代谢物的高灵敏、高通量分析尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的正是基于上述现有技术状况，针对体液内烟气代谢物分析检测过程中，离线操作效率低、分析通量低和灵敏度低等方面的问题，提供一种集成化在线样品预处理装置及其应用，构建了集酶水解-固相萃取富集-液相色谱分离-质谱鉴定分析的一体化样品预处理分析平台。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：一种集成化在线样品预处理装置，即将酶反应器、固相萃取柱与液相色谱-质谱系统在线联用，构建集酶水解-固相萃取富集-液相色谱-质谱分离分析的一体化样品预处理分析平台系统，具体包括一级切换阀，二级切换阀，连接在两级切换阀之间的酶反应器，连接在一级切换阀上的定量环和固相萃取柱Ⅰ，连接在二级切换阀上的固相萃取柱Ⅱ和分离柱及质谱仪；所述一级切换阀为十通阀，定量环连接在一级切换阀的B、E位之间、并可切换连接在J、G位，固相萃取柱Ⅰ连接在一级切换阀的C、G位之间，一级切换阀的D位和I位分别连接有输液泵，一级切换阀的A位、F位分别为进样口和废液出口；所述二级切换阀为六通阀，固相萃取柱Ⅱ连接在二级切换阀的B、E位之间，质谱仪通过分离柱连接在二级切换阀的C位，二级切换阀的D位连接有输液泵，F位为废液出口；所述酶反应器的进、出口分别连接在一级切换阀的H位和二级切换阀的B位。在本专利技术中，所述酶反应器是以微米或纳米颗粒基质为载体，包括聚合物颗粒、碳颗粒、硅氧化物颗粒或复合材料颗粒基质；或者是以整体材料基质为载体，包括聚合物整体材料、硅基质整体材料、有机无机杂化基质整体材料；或者是纳米颗粒掺杂的整体材料，包括金纳米颗粒掺杂或其他无机纳米颗粒掺杂；酶是蛋白酶、脂肪酶、β-葡萄糖醛酸酶、萄糖氧化酶中的一种或多种；酶以物理吸附、包埋或共价键合方式中的任意一种或两种修饰在基质材料表面。所述定量环规格为2 μL-5 mL范围中的任意一种。所述泵的流量为1 nL/min.-5mL/min。连接在一、二级切换阀上的固相萃取柱均可以是阳离子交换柱、阴离子交换柱、混合型离子交换柱、正相萃取柱、反相萃取柱、分子印迹柱中任意一种。所述分离柱可为反相色谱柱、正相色谱柱、疏水色谱柱、亲和色谱柱、固定化金属亲和色谱柱或体积排阻色谱柱。将本专利技术的集成化在线样品预处理装置用于分析检测烟气代谢物，依次包括以下五大步骤：（1）通过固相萃取柱（4）对样品进行初步富集与净化；（2）通过酶反应器（5）实现目标代谢物的高效水解；（3）通过串联固相萃取柱（7），对水解后目标物进行富集净化；（4）采用分离柱9对目标分析物进行分离；（5）质谱仪10分析检测目标代谢物碎片离子。分析检测过程包括五个管路连接模式：①进样模式（参见图2）：一级切换阀（3）的AB位相通，将定量环连接在一级切换阀（3）的B、E位，完成进本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种集成化在线样品预处理装置，其特征在于：即将酶反应器（5）、固相萃取柱、与液相色谱‑质谱系统在线联用，构建集酶水解‑固相萃取富集‑液相色谱‑质谱分离分析的一体化样品预处理分析平台系统，具体包括一级切换阀（3），二级切换阀（6），连接在两级切换阀之间的酶反应器（5），连接在一级切换阀（3）上的定量环（2）和固相萃取柱Ⅰ（4），连接在二级切换阀（6）上的固相萃取柱Ⅱ（7）和分离柱（9）及质谱仪（10）；所述一级切换阀（3）为十通阀，定量环（2）连接在一级切换阀的B、E位之间、并可切换连接在J、G位，固相萃取柱Ⅰ（4）连接在一级切换阀的C、G位之间，一级切换阀（3）的D位和I位分别连接有输液泵（1、11），一级切换阀的A位、F位分别为进样口和废液出口；所述二级切换阀（6）为六通阀，固相萃取柱Ⅱ（7）连接在二级切换阀的B、E位之间，质谱仪（10）通过分离柱（9）连接在二级切换阀（6）的C位，二级切换阀（6）的D位连接有输液泵（8），F位为废液出口；所述酶反应器（5）的进、出口分别连接在一级切换阀（3）的H位和二级切换阀（6）的B位。

【技术特征摘要】
1.一种集成化在线样品预处理装置，其特征在于：即将酶反应器（5）、固相萃取柱、与液相色谱-质谱系统在线联用，构建集酶水解-固相萃取富集-液相色谱-质谱分离分析的一体化样品预处理分析平台系统，具体包括一级切换阀（3），二级切换阀（6），连接在两级切换阀之间的酶反应器（5），连接在一级切换阀（3）上的定量环（2）和固相萃取柱Ⅰ（4），连接在二级切换阀（6）上的固相萃取柱Ⅱ（7）和分离柱（9）及质谱仪（10）；所述一级切换阀（3）为十通阀，定量环（2）连接在一级切换阀的B、E位之间、并可切换连接在J、G位，固相萃取柱Ⅰ（4）连接在一级切换阀的C、G位之间，一级切换阀（3）的D位和I位分别连接有输液泵（1、11），一级切换阀的A位、F位分别为进样口和废液出口；所述二级切换阀（6）为六通阀，固相萃取柱Ⅱ（7）连接在二级切换阀的B、E位之间，质谱仪（10）通过分离柱（9）连接在二级切换阀（6）的C位，二级切换阀（6）的D位连接有输液泵（8），F位为废液出口；所述酶反应器（5）的进、出口分别连接在一级切换阀（3）的H位和二级切换阀（6）的B位。2.根据权利要求1所述的集成化在线样品预处理装置，其特征在于：所述酶反应器（5）是以微米或纳米颗粒基质为载体，包括聚合物颗粒、碳颗粒、硅氧化物颗粒或复合材料颗粒基质；或者是以整体材料基质为载体，包括聚合物整体材料、硅基质整体材料、有机无机杂化基质整体材料；或者是纳米颗粒掺杂的整体材料，包括金纳米颗粒掺杂或其他无机纳米颗粒掺杂；酶是蛋白酶、脂肪酶、β-葡萄糖醛酸酶、萄糖氧化酶中的一种或多种；酶以物理吸附、包埋或共价键合方式中的任意一种或两种修饰在基质材料表面。3.根据权利要求1所述的集成化在线样品预处理装置，其特征在于：所述定量环（2）规格为2 μL-5 mL范围中的任意一种。4.根据权利要求1所述的集成化在线样品预处理装置，其特征在于：所述固相萃取柱Ⅰ（4）、固相萃取柱Ⅱ（7）均可为阳离子交换柱、阴离子交换柱、混合型离子交换柱、正相...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓楠，李斌，朱文魁，鲁端峰，张明建，王乐，张柯，王兵，
申请(专利权)人：中国烟草总公司郑州烟草研究院，
类型：发明
国别省市：河南;41