一种同位素稀释超高效液相色谱质谱联用测定维生素K1的方法技术

本发明专利技术公开了一种同位素稀释超高效液相色谱质谱联用快速灵敏地测定维生素K1的方法，包括如下步骤：(1)维生素K1对照品溶液和维生素K1同位素内标溶液配制；(2)建立维生素K1标准曲线；(3)采集待测样品溶液的色谱图；(4)待测样品中维生素K1浓度的确定。本发明专利技术的同位素稀释超高效液相色谱质谱联用测定维生素K1的方法用于血清中维生素K1的测定时，简单快速、准确度高、专属性强、精密度高、灵敏度好。

【技术实现步骤摘要】
一种同位素稀释超高效液相色谱质谱联用测定维生素K1的方法
本专利技术涉及一种同位素稀释超高效液相色谱质谱联用快速灵敏测定维生素K1的方法。
技术介绍
维生素K1又称植物甲萘醌，是一种脂溶性维生素，为人体肝内合成凝血酶原的必需物质，可促进凝血酶原(II因子)及其它凝血因子(VIII、IX、X因子)的前体物质羧化反应，进而转变成凝血酶原和相应的凝血因子。临床常用于皮肤黏膜出血、内脏出血、外伤手术后出血、新生儿出血及其他深部组织出血等的治疗。此外，维生素K1还参与骨代谢和细胞生长，具有镇痛、缓解支气管痉挛的作用。维生素K1的检测方法可应用于多个方面，比如科研研究，单纯性数据检测等，并非限定于诊断，而且临床疾病诊断是一个综合评价，本指标不能完全反映某种疾病的诊断情况，仅作为一种辅助参考。维生素K1对维系人体健康十分重要，因此，需要建立一种简单快速、准确灵敏测定维生素K1的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种简单快速、灵敏准确的测定维生素K1含量的同位素稀释超高效液相色谱质谱联用测定维生素K1的方法。为了达到上述目的，本专利技术所采用的方案为：一种同位素稀释超高效液相色谱质谱联用测定维生素K1的方法，该方法包括以下步骤：S1：配制维生素K1对照品溶液和维生素K1同位素内标溶液的步骤；用甲醇分别溶解维生素K1和维生素K1同位素内标，制成已知浓度的维生素K1对照品储备液和已知浓度的维生素K1同位素内标储备液；用甲醇将已知浓度的维生素K1对照品储备液分别稀释成一系列具有不同已知浓度的维生素K1对照品溶液；用甲醇将已知浓度的维生素K1同位素内标储备液稀释成已知浓度的维生素K1同位素内标溶液；S2：建立维生素K1标准曲线的步骤：分别吸取一定体积(V1)的具有不同已知浓度的维生素K1对照品溶液，加入1～5倍于体积(V1)的维生素K1同位素内标溶液，涡旋混匀，加入1～10倍于体积(V1)的萃取溶液，涡旋混匀，离心，取一定体积(V2)的上清液，室温下氮气吹干，加入一定体积(V3)的复溶剂，涡旋混匀，离心，得到一系列具有不同已知浓度的维生素K1标准曲线工作液；在相同的超高效液相色谱质谱条件下，将一定体积(V4)的具有不同已知浓度的维生素K1标准曲线工作液分别注入超高效液相色谱质谱联用仪中，获得一系列具有不同已知浓度的维生素K1标准曲线工作液的色谱图(LC-MS/MS色谱图)；以维生素K1标准曲线工作液的色谱图中维生素K1色谱峰峰面积与维生素K1同位素内标色谱峰峰面积的比值为纵坐标或横坐标，以相应的维生素K1标准曲线工作液的维生素K1浓度为横坐标或纵坐标，建立维生素K1标准曲线；S3：采集待测样品溶液的总离子色谱图的步骤；吸取一定体积(V1)的待测样品，加入1～5倍于体积(V1)的维生素K1同位素内标溶液，涡旋混匀，加入1～10倍于体积(V1)的萃取溶液，涡旋混匀，离心，取一定体积(V2)的上清液，室温下氮气吹干，加入一定体积(V3)的复溶剂，涡旋混匀，离心，得待测样品溶液；在与S2步骤中相同的超高效液相色谱质谱条件下，取一定体积(V4)的待测样品溶液注入超高效液相色谱质谱联用仪中，获得待测样品溶液的色谱图；S4：计算待测样品中维生素K1浓度的步骤；将待测样品溶液色谱图中维生素K1色谱峰峰面积与维生素K1同位素内标色谱峰峰面积的比值带入已建立的维生素K1标准曲线，计算出待测样品中维生素K1的浓度。该方案的测定方法简单快速、准确度高、专属性强、精密度高、灵敏度好，可用于不同类型样品中的维生素K1含量的测定，特别是维生素K1含量较少的样品，如血清的测定。当上述方案适用于不同样品时，随着待测样品中维生素K1含量的变化，有可能认为其测试结果不一定准确；为了提高测试结果的证明力，所述方法还包括：S5：采集加标回收率样品/质控样品溶液的色谱图的步骤；吸取一定体积(mV1，0<m<1)的待测样品，加入若干体积((1-m)V1)的不同已知浓度的维生素K1对照品溶液，并使两者体积之和与S3步骤待测样品体积相同(mV1+(1-m)V1＝V1)；加入1～5倍于前述总体积(V1)的维生素K1同位素内标溶液，涡旋混匀，加入1～10倍于待测样品和对照品总体积(V1)的萃取溶液，涡旋混匀，离心，取一定体积的上清液，室温下氮气吹干，加入一定体积的复溶剂，涡旋混匀，离心，得到不同浓度的加标回收率样品/质控样品溶液；在与S2步骤中相同超高效液相色谱质谱条件下，取一定体积的加标回收率样品/质控样品溶液注入超高效液相色谱质谱联用仪中，获得加标回收率样品/质控样品溶液的色谱图；将加标回收率样品/质控样品溶液色谱图中维生素K1色谱峰峰面积与维生素K1同位素内标色谱峰峰面积的比值带入已建立的维生素K1标准曲线，计算出加标回收率样品/质控样品中维生素K1的浓度；S6：计算加标回收率的步骤：回收率％＝(测得浓度-待测样品平均浓度)/加标浓度×100％。通过加标回收率的计算，可以明显、直观地看出该测试方法的测量精度，从而可以使测量结果更具说服力。另外，为了使加标回收率样品的测试结果与标准曲线工作液和待测样品溶液的测量条件更为接近，可使各对应步骤的溶液体积是相同的；例如，当获得加标回收率样品溶液的色谱图的步骤中吸取的待测样品和对照品溶液的体积分别为mV1(0<m<1)和(1-m)V1，此时的加标回收率的计算公式则为：回收率％＝(测得浓度-待测样品平均浓度*m)/[加标浓度*(1-m)]×100％此外，在待测样品检测过程中均匀加入不同浓度的质控样品，通过评价质控样品的精密度和准确度，来评价待测样品检测结果的准确性，进而确保待测样品检测结果的可靠性。优选地，所述超高效液相色谱质谱条件包括：色谱条件：色谱柱：采用十八烷基硅烷键合的固定相；流动相：酸水溶液-酸/盐有机相溶液；流动相的流速：0.3～0.5mL/min；柱温：30～60℃；进样量：2～20μL；质谱条件：离子源：电喷雾离子源；扫描模式：正离子模式；检测模式：多反应监测；毛细管电压：5500V；离子源温度：550℃；离子源雾化气：40psi；离子源加热辅助气：60psi；气帘气：30psi；碰撞气：4psi。更佳地，扫描模式为多反应监测，多反应监测条件如下优选地，所述流动相为甲酸水溶液-甲酸甲酸铵甲醇溶液或0.1％甲酸水溶液-0.1％甲酸2mM甲酸铵甲醇溶液。优选地，所述离子源雾化气、离子源加热辅助气、气帘气和碰撞气中的气体均为氮气。优选地，所述萃取溶剂为正己烷、乙酸乙酯、乙醚、二氯甲烷等中的至少一种；优选地，所述复溶剂为纯水、甲醇、乙腈、乙醇等中的至少一种。优选地，所述维生素K1同位素内标为2H7-维生素K1。优选地，所述维生素K1对照品溶液的一系列具有不同已知浓度范围为0.1～20ng/mL。优选地，所述涡旋混匀的时间为0.5～5min；优选地，所述离心条件为：4℃、10000～15000r/min、10～20min。本专利技术的测定维生素K1的同位素稀释超高效液相色谱质谱联用方法用于维生素K1的测定时，简单灵敏、快速准确、专属性强、精密度高、重复性好、准确度高；并且适用范围广泛，对于维生素K1含量少的血清等样品的检测尤其合适。附图说明图1浓度均为1ng/mL的维生素K1及2H7-维生素K1的典本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种同位素稀释超高效液相色谱质谱联用测定维生素K

【技术特征摘要】
1.一种同位素稀释超高效液相色谱质谱联用测定维生素K1的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：S1：配制维生素K1对照品溶液和维生素K1同位素内标溶液的步骤；用甲醇分别溶解维生素K1和维生素K1同位素内标，制成已知浓度的维生素K1对照品储备液和已知浓度的维生素K1同位素内标储备液；用甲醇将维生素K1对照品储备液和维生素K1同位素内标储备液分别稀释成一系列具有不同已知浓度的维生素K1对照品溶液和已知浓度的维生素K1同位素内标溶液；S2：建立维生素K1标准曲线的步骤：分别吸取一定体积的具有不同已知浓度的维生素K1对照品溶液，加入1～5倍体积的维生素K1同位素内标溶液，涡旋混匀，加入1～10倍体积的萃取溶液，涡旋混匀，离心，取一定体积的上清液，室温下氮气吹干，加入一定体积的复溶剂，涡旋混匀，离心，得到一系列具有不同已知浓度的维生素K1标准曲线工作液；在相同的超高效液相色谱质谱条件下，将一定体积的具有不同已知浓度的维生素K1标准曲线工作液分别注入超高效液相色谱质谱联用仪中，获得一系列具有不同已知浓度的维生素K1标准曲线工作液的色谱图；以维生素K1标准曲线工作液的色谱图中维生素K1色谱峰峰面积与维生素K1同位素内标色谱峰峰面积的比值为纵坐标或横坐标，以相应的维生素K1标准曲线工作液的维生素K1浓度为横坐标或纵坐标，建立维生素K1标准曲线；S3：采集待测样品溶液的色谱图的步骤；吸取一定体积的待测样品，加入1～5倍体积的维生素K1同位素内标溶液，涡旋混匀，加入1～10倍体积的萃取溶液，涡旋混匀，离心，取一定体积的上清液，室温下氮气吹干，加入一定体积的复溶剂，涡旋混匀，离心，得待测样品溶液；在与S2步骤中相同的超高效液相色谱质谱条件下，取一定体积的待测样品溶液注入超高效液相色谱质谱联用仪中，获得待测样品溶液的色谱图；S4：计算待测样品中维生素K1浓度的步骤；将待测样品溶液色谱图中维生素K1色谱峰峰面积与维生素K1同位素内标色谱峰峰面积的比值带入已建立的维生素K1标准曲线，计算出待测样品中维生素K1的浓度。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：S5：采集加标回收率样品/质控样品溶液的色谱图的步骤；吸取一定体积的待测样品，加入若干体积的不同已知浓度的维生素K1对照品溶液，并使两者体积之和与S3步骤待测样品体积相...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭军，江振作，陈从艳，田天，许洪涛，吴超超，高强，
申请(专利权)人：杭州佰辰医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33