非衍生化检测人体血浆中多种氨基酸的液相质谱方法技术

本发明专利技术公开了一种非衍生化检测人体血浆中多种氨基酸的液相质谱方法，包括以下步骤：(1)取人体血浆，用磺基水杨酸进行脱蛋白，得上清液；(2)将上清液与含挥发性离子化试剂的内标溶液混合，采用LC‑MS/MS进行分析，色谱条件为：流动相A：1mM全氟庚酸水溶液；流动相B：1mM全氟庚酸乙腈溶液；梯度洗脱；质谱条件为：正离子电喷雾离子化的多离子反应监测。本发明专利技术在样品及流动相体系中加入挥发性离子化试剂样品，分析时间短，提高了分析的效率，操作简单，提高了实验结果的准确性。本发明专利技术采用LC‑MS/MS检测人体血浆中二十种氨基酸，特异性强，灵敏性高，通量高，操作简单，样品处理简单，检测时间短，尤其适合临床普及应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种非衍生化高效检测人体血浆中多种氨基酸的液相质谱方法，属于氨基酸检测

技术介绍
胺类物质是人体代谢的基础，其主要代表氨基酸更是构成蛋白质的基本单位，具有重要的生化活性。二肽是由两个氨基酸脱水缩合形成的酰胺键组成的蛋白质片段或物质，与营养、荷尔蒙、酵素抑制、调节免疫、抗菌、抗病毒、抗氧化有非常紧密关系。此外，研究表明氨基酸的甲基化、乙酰化产物与人体健康状况密切相关，是肿瘤发生发展的重要特征。因此，实现胺类物质进行代谢轮廓分析，对研究人体生理状态，疾病进程以及疗效评价等都具有重要的研究意义。胺类物质极性强，在反相液相色谱中难以保留，离子抑制严重，定量分析困难。目前，常用的定量分析方法是通过液相色谱-串联质谱多反应检测方法(LC-MRM)。这种方法速度快，样品预处理简单。但是由于不同的胺类物质极性差异较大，许多胺类物质色谱保留能力弱，且在离子化过程中的差异较大，许多胺类在电喷雾离子源中的离子化效率很低，造成其检测灵敏度差。因此在实际检测中，目前一般只能进行定性分析，或针对高含量的氨基酸进定量分析。为了解决这个问题，有研究者采用衍生化方法来提高离子化效率，从而达到定量分析的目的，但由于衍生化技术的操作复杂、耗时性以及缺乏特异性，无法适用于临床血样样本的高通量分析。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术提供了一种非衍生化检测人体血浆中多种氨基酸的液相质谱方法。本专利技术通过不断的研究与探索，采用挥发性离子对试剂，不需要对氨基酸进行衍生化就可以对其进行直接分析，在本专利技术中，在流动相体系中加入离子对试剂，无需对对血液样品衍生化，就可以达到较高的检测灵敏性、特异性，由于样品前处理简单，分析时间也很短(20分钟以内)，从而可以满足临床血样样本的高通量分析。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种非衍生化检测人体血浆中多种氨基酸的液相质谱方法，所述多种氨基酸选自天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸以及赖氨酸中的两种以上或全部；包括以下步骤：(1)取人体血浆，用磺基水杨酸进行脱蛋白，得到含有多种氨基酸的上清液；(2)将上述上清液与含挥发性离子化试剂的内标溶液混合，采用LC-MS/MS进行分析。进一步地，所述步骤(1)具体为：取人体血浆样品，置于离心管中，加入等体积的质量浓度为1％～8％(优选6％)的磺基水杨酸的内标溶液，震荡混匀，13000rpm下离心5min，取上清液，置于干净的离心管中，备用。进一步地，所述步骤(2)中，挥发性离子化试剂选自七氟丁酸、九氟戊酸或全氟庚酸，优选全氟庚酸；挥发性离子化试剂的浓度为1.5～2.5mM；所述内标溶液是由0.375uM氨基葡萄糖酸溶液和0.25uMS-2氨基乙基半胱氨酸溶液混合而成的(甘氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺以及谷氨酸的内标物为氨基葡萄糖酸；其余氨基酸的内标物为S-2氨基乙基半胱氨酸)，二者体积比为0.8～1.2:0.8～1.2；上清液与含挥发性离子化试剂的内标溶液的体积比为1:75～85。所述LC-MS/MS的条件为：色谱条件：流动相A：1mM全氟庚酸水溶液；流动相B：1mM全氟庚酸乙腈溶液；梯度洗脱；色谱柱：预柱：ThermoFisher,3umHypercarb,4.6mm*50mm,柱温：40℃；分析柱：AvancedMaterials,2.7umHaloC18,2.1mm*100mm，柱温：65℃；预柱和分析柱用切换伐(十通阀)连接(在预柱和分析柱中间加入一个切换伐，目的是将血浆中的杂质尽可能的除去，使其不进入检测器，一方面减少对测定的影响，另一方面减少对仪器的污染)；质谱条件：采用正离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式，气化温度：300℃；NEB:60psi；喷雾电压：2100V；去溶剂温度：350℃。优选的，梯度洗脱条件如表1所示。表1梯度洗脱条件备注：1.7分钟前从预柱流出的液体经过切换伐进入废液瓶，1.7分钟时切换伐切换，从预柱流出的液体进入分析柱和质谱检测器分析检测。优选的，MRM质谱参数如表2所示。表2二十种氨基酸及内标的质谱条件条件优选的，一种非衍生化检测人体血浆中多种氨基酸的液相质谱方法，步骤如下：(1)样品前处理：向血清样本中加入等体积的6％磺基水杨酸的内标溶液，涡旋震荡后13000rpm转速离心5分钟，取上清液10ul，加入800ul2mM全氟庚酸的内标溶液，均匀混合，进样分析；进行样品前处理的有益效果是：通过该处理，有效的分离沉淀蛋白，去除杂质，减少干扰，降低基质效应，同时可以最大程度的保留氨基酸，并加入挥发性离子化试剂，提高质谱检测的灵敏性；(2)标准工作液的配制：以0.1NHCL配制各氨基酸储备液，然后用浓度为5％(单位g/ml)的BSA(牛血清白蛋白)甲醇溶液制备6个梯度(10、50、100、250、500、1000uM)的混合标准溶液，分装于1.5mL棕色瓶中，-20℃保存备用；(3)LC-MS/MS检测：将待测样本通过梯度洗脱模式进入色谱柱分离后，采用正离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式，对待测物质进行定性(以各种氨基酸的离子对及相对保留时间作为定性依据)与定量检测(以标准品制作标准曲线定量)。进一步地，进行定量检测时，应用标准品制作标准曲线，以标准溶液浓度为X轴，标准品峰面积和内标峰面积比值为Y轴，进行线性回归分析得回归方程，将相应维生素峰面积代入标准曲线方程，分别计算血清样品中氨基酸的浓度。本专利技术还提供了一种非衍生化检测人体血浆中多种氨基酸的检测试剂盒，具有不同梯度浓度的各氨基酸标准溶液，质量浓度为1％～8％的磺基水杨酸的内标溶液，含挥发性离子化试剂的内标溶液；所述挥发性离子化试剂选自七氟丁酸、九氟戊酸或全氟庚酸，挥发性离子化试剂的浓度为1.5～2.5mM；所述内标溶液是由0.375uM氨基葡萄糖酸溶液和0.25uMS-2氨基乙基半胱氨酸溶液混合而成的，二者体积比为0.8～1.2:0.8～1.2；1mM全氟庚酸水溶液，1mM全氟庚酸乙腈溶液。传统的氨基酸含量检测方法有很多缺点，为了在色谱柱上得到理想的保留行为以及提高检测灵敏性，通常需要进行样本的柱前或柱后衍生化，不但操作过程繁琐，费时费力，而且操作误差较大，影响实验结果的准确性。本专利技术通过在流动相体系中加入挥发性离子化试剂(用以提高氨基酸在MS中的离子化程度，实现多种非衍生化氨基酸的准确定量)，建立了一种快速、灵敏、便捷的非衍生化血液样品中多种氨基酸测定方法，特别是同时测定血清中天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸以及赖氨酸的方法。采用本专利技术可以同时检测人血清中20种基本氨基酸的含量，并进行精确的定性和定量分析，是一种样本处理简单、快速、通量高、结果可靠的检测方法。天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸以及赖氨酸是人体内重要的氨基酸，任何一种氨基酸的缺乏或升高都会导致相应的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种非衍生化检测人体血浆中多种氨基酸的液相质谱方法，所述氨基酸选自天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸以及赖氨酸中的两种以上或全部；其特征在于：包括以下步骤：(1)取人体血浆，用磺基水杨酸进行脱蛋白，得上清液；(2)将上述上清液与含挥发性离子化试剂的内标溶液混合，采用LC‑MS/MS进行分析；所述挥发性离子化试剂选自七氟丁酸、九氟戊酸或全氟庚酸；所述内标溶液是由0.375uM氨基葡萄糖酸溶液和0.25uM S‑2氨基乙基半胱氨酸溶液混合而成的，二者体积比为0.8～1.2:0.8～1.2；LC‑MS/MS的色谱条件为：流动相A：1mM全氟庚酸水溶液；流动相B：1mM全氟庚酸乙腈溶液；梯度洗脱；LC‑MS/MS的质谱条件为：正离子电喷雾离子化的多离子反应监测。

【技术特征摘要】
1.一种非衍生化检测人体血浆中多种氨基酸的液相质谱方法，所述氨基酸选自天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸以及赖氨酸中的两种以上或全部；其特征在于：包括以下步骤：(1)取人体血浆，用磺基水杨酸进行脱蛋白，得上清液；(2)将上述上清液与含挥发性离子化试剂的内标溶液混合，采用LC-MS/MS进行分析；所述挥发性离子化试剂选自七氟丁酸、九氟戊酸或全氟庚酸；所述内标溶液是由0.375uM氨基葡萄糖酸溶液和0.25uMS-2氨基乙基半胱氨酸溶液混合而成的，二者体积比为0.8～1.2:0.8～1.2；LC-MS/MS的色谱条件为：流动相A：1mM全氟庚酸水溶液；流动相B：1mM全氟庚酸乙腈溶液；梯度洗脱；LC-MS/MS的质谱条件为：正离子电喷雾离子化的多离子反应监测。2.根据权利要求1所述的非衍生化检测人体血浆中多种氨基酸的液相质谱方法，其特征在于：所述步骤(1)具体为：取人体血浆样品，置于离心管中，加入等体积的质量浓度为1％～8％的磺基水杨酸的内标溶液，震荡混匀，13000rpm下离心5min，取上清液，置于离心管中，备用。3.根据权利要求1所述的非衍生化检测人体血浆中多种氨基酸的液相质谱方法，其特征在于：所述步骤(2)中，挥发性离子化试剂的浓度为1.5～2.5mM；上清液与含挥发性离子化试剂的内标溶液的体积比为1:75～85。4.根据权利要求1所述的非衍生化检测人体血浆中多种氨基酸的液相质谱方法，其特征在于：所述LC-MS/MS的色谱条件为：流动相A：1mM全氟庚酸水溶液；流动相B：1mM全氟庚酸乙腈溶液；梯度洗脱；色谱柱：预柱：ThermoFisher,3umHypercarb,4.6...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈大为，
申请(专利权)人：陈大为，
类型：发明
国别省市：山东;37