本发明专利技术涉及生物体液中夹竹桃苷和夹竹桃苷乙的液相色谱-串联质谱检验方法，包括如下步骤：取液体样品或组织样品剪碎于具塞试管中；取上述制备好的样品，加入的乙酸乙酯两次，每次振荡10min，离心10min，合并两次有机相，空气浓缩仪上浓缩至0.5mL，过0.22μm微孔有机滤膜，滤液供液相色谱-串联质谱仪分析。本发明专利技术的检测方法简单高效、快速灵敏、准确度高，具有广泛的实用性，能够应用于生物样品中夹竹桃苷和夹竹桃苷乙的定性定量检验，以及适用于体外样品和可疑物证的检验。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物样品检验领域，具体涉及生物体液中夹竹桃苷和夹竹桃苷乙的液 相色谱-串联质谱检验方法。
技术介绍
夹竹桃（Neriumindicum. Mill)为夹竹桃属常绿灌木。现代医学研宄证明，夹竹 桃味苦性寒，具有强心、利尿、抗癌、抗炎、镇静安神等作用，但是夹竹桃的叶皮根花均有 毒，日常生活当中，常因药用或误服过量夹竹桃而出现头痛、头晕、恶心、呕吐、腹痛、腹泻、 谵语、甚则汗出肢厥、心律失常、直至休克死亡。
技术实现思路
本专利技术提供， 适用于生物样品（血、尿、肝、肾等）中夹竹桃苷和夹竹桃苷乙的定性定量检验，也适用于体 外样品和可疑物证的检验。 本专利技术的原理是以空白样品和添加样品作对照，按平行操作的要求，对体液样品 样进行提取、净化及浓缩，用LC-MS/MS进行检测，以保留时间（Rt)、质谱特征离子碎片峰和 相对丰度作为定性判断依据；与平行操作的添加标准品响应值比较，根据峰面积之比，用外 标法进行定量分析。 具体的，本专利技术一方面的目的在于提供生物体液中夹竹桃苷和夹竹桃苷乙的液相 色谱-串联质谱检验方法，其特征在于，包括如下步骤： a)取液体样品或组织样品剪碎于具塞试管中；取上述制备好的样品，加入 5. 0-10.0 mL的乙酸乙醋两次，每次振荡lOmin，离心10min，合并两次有机相，空气浓缩仪上 浓缩至0. 5mL，过0. 22 μ m微孔有机滤膜，滤液供液相色谱-串联质谱仪分析； b)样品分析： 色谱柱：kinetex C18 ;柱温：40°C ;进样量：10 μ L ;流动相：A为乙腈，B为用甲酸 调节pH为3. 5的IOmM甲酸按水溶液（本专利技术中：IOmM甲酸按水溶液是指甲酸按的浓度 为10mmol/L，用甲酸调节其pH为3. 5,以下不再赘述）；梯度洗脱：0. 2min，A为10%，B为 90%;3· 0min，A 为 95%，B 为 5%;5· 0min，A 为 95%，B 为 5%;5· lmin，A 为 10%，B 为 90%; 7. Omin，A 为 10%，B 为 90% ;流速为 0· 5mL/min ; 离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描（ESI+);检测方式：多反应监测 (MRM)，两对离子对定性，其中一对离子对定量；电喷雾电压：5500V ;离子源温度：550°C ;雾 化气压力：55psi ;气帘气压力：35psi ;辅助气压力：55psi。 优选地，上述乙酸乙酯的加入量为5. OmL-10.0 mL。 在本专利技术的另一个实施方案中，尤其是对于新鲜血液样品，其中a)样品前处理还 能够替换为：移取液体样品，加入的PH5. 8磷酸盐缓冲液，混匀后，将样品加入固相支撑液 液萃取柱中，用正压将样品压入柱中，静置5min，将乙酸乙酯分两次加入到萃取柱中，流速 为0. 5mL/min~1.0 mL/min ;再将柱中残余的液体挤出；萃取完毕后，将萃取液用氮气流吹 至干，然后用初始流动相定容至〇. 5mL，过0. 22 μ m微孔有机滤膜，滤液供液相色谱-串联质 谱仪分析。 优选地，上述pH5. 8磷酸盐缓冲液的加入量为0. 5mL ;优选地，上述乙酸乙酯的加 入量为8mL。 在本专利技术的一个具体的实施方式中，其中a)样品前处理步骤中，还包括另取3份 相同基质的空白样品，1份作为空白样品，另2份添加夹竹桃苷和夹竹桃苷乙混标0.1 yg作 为添加样品；或者还包括准确量取液体样品1.0 mL~2. OmL或均衆后的固体样品1.0 g~ 2. Og，添加有机磷标准品混标，混匀。 在本专利技术的一个具体的实施方式中，液体样品为血液、尿液、唾液；所述组织样品 为肝脏、肾脏。 在本专利技术的一个具体的实施方式中，C18柱为3. 0mmX50mm，2. 6 μπι柱。 在本专利技术的一个优选的实施方式中，取液体样品1.0mL-2. OmL;或者组织样品 1.0 g-2. 0g〇 本专利技术另一方面的目的在于提供生物体液中夹竹桃苷和夹竹桃苷乙的液相色 谱-串联质谱检验方法的应用，应用于法庭科学领域，尤其是应用于生物样品中夹竹桃苷 和夹竹桃苷乙的定性定量检验，以及适用于体外样品和可疑物证的检验。 优选地，所述生物样品为血、尿、肝、肾。 本专利技术的有益效果在于：本专利技术样品处理采用液液萃取或者固相萃取，操作简单， 样品用量少；采用LC-MS/MS灵敏度高，能有效的排除假阳性，定性、定量准确度高。【附图说明】 图1表示夹竹桃苷质谱图； 图2表示夹竹桃苷乙质谱图； 图3A和图3B表示夹竹桃苷MRM离子色谱图； 图4A和图4B表示夹竹桃苷乙MRM离子色谱图。【具体实施方式】 实施例1定性分析 1、试剂 本专利技术除有说明外所用试剂均为分析纯，试验用水为三级水（见GB/T 6682-2008 规定）； 乙腈：色谱纯； 甲醇：色谱纯； 甲酸：色谱纯； 甲酸铵：色谱纯； 磷酸盐缓冲液（pH 5. 8):取磷酸二氢钾8. 34g与磷酸氢二钾0. 87g，分别置于 1000 mL容量瓶中，加一级水溶解、稀释至刻度； 纯水（电阻率彡18ΜΩ · CM)。 液液支撑固相萃取柱，60mg，lmL。 有机滤膜，0.22 μ m。 标准溶液： 1)夹竹桃苷和夹竹桃苷乙储备液：精确称取夹竹桃苷和夹竹桃苷乙标准品各 l〇mg，分别于IOmL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，混匀，配制成1.0 mg/mL钩吻素甲和 钩吻素子标准储备液，冷藏保存6个月； 2)夹竹桃苷和夹竹桃苷乙标准工作液：精确量取1.0 mg/mL夹竹桃苷和夹竹桃苷 乙标准储备液各lmL，分别于IOmL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成0. lOmg/mL的夹竹 桃苷和夹竹桃苷乙标准工作液，冷藏保存1个月。试验中所用其它浓度的标准溶液均从上 述储备溶液用甲醇稀释而得，冷藏保存为1个月。 2、仪器和材料 a)高效液相色谱-串联质谱仪； b)电子分析天平：感量为0· OOOlg和0· Olg ; c)尚速振汤器； d)高速离心机； e)匀浆机； f)浓缩仪； j)涡旋混合器； h)微量移液器：量程 5 μ L ~100 μ L, 100 μ L ~1000 μ L ; i)微孔滤膜：0·22μπι; 3、样品萃取 3. 1、液液萃取 取血液等液体样品1.0 mL~2. OmU或肝脏等固体样品（匀浆后）1.0 g~2. Og于 具塞试管中，另取3份相同基质的等量空白样品于具塞试管中，1份作为空白样品，另2份添 加有夹竹桃昔和夹竹桃昔乙混标〇. I y g作为添加样品。 取上述制备好的样品，加入5. 0-10.0 mL的乙酸乙酯两次，每次振荡lOmin，离心 lOmin，合并两次有机相，空气浓缩仪上浓缩至0. 5mL，过0. 22 μ m微孔有机滤膜，滤液供液 相色谱-串联质谱仪分析。 3. 2、固相萃取（适用于新鲜血液） 移取血液0. 5mL，加入0. 5mL的pH5. 8磷酸盐缓冲液，混匀后，将样品加入固相支 撑液液萃取柱中，用正压将样品压入柱中，静置5min，将SmL乙酸乙酯分两次加入到萃取 柱中，流速为〇. 5mL/min~1.0 mL/min ;再将柱中残余的液体挤出；萃取完毕后，将萃取液用 氮气流吹至干，然后用初始流动相定容至0. 5mL，过0. 22本文档来自技高网...
【技术保护点】
生物体液中夹竹桃苷和夹竹桃苷乙的液相色谱‑串联质谱检验方法，其特征在于，包括如下步骤：a)取液体样品或组织样品剪碎于具塞试管中；取上述制备好的样品，加入5.0～10.0mL的乙酸乙酯两次，每次振荡10min，离心10min，合并两次有机相，空气浓缩仪上浓缩至0.5mL，过0.22μm微孔有机滤膜，滤液供液相色谱‑串联质谱仪分析；b)样品分析：色谱柱：kinetex C18；柱温：40℃；进样量：10μL；流动相：A为乙腈，B为用甲酸调节pH为3.5的10mM甲酸铵水溶液；梯度洗脱：0.2min，A为10％，B为90％；3.0min，A为95％，B为5％；5.0min，A为95％，B为5％；5.1min，A为10％，B为90％；7.0min，A为10％，B为90％；流速为0.5mL/min；离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描(ESI+)；检测方式：多反应监测(MRM)，两对离子对定性，其中一对离子对定量；电喷雾电压：5500V；离子源温度：550℃；雾化气压力：55psi；气帘气压力：35psi；辅助气压力：55psi。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王芳琳，栾玉静，应剑波，姚伊人，刘耀，
申请(专利权)人：公安部物证鉴定中心，
类型：发明
国别省市：北京;11
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