一种测定甘蔗中不同形式植物甾醇含量的方法技术

本发明专利技术公开了一种测定甘蔗中不同形式植物甾醇含量的方法，该方法将甘蔗样品中植物甾醇进行酸式水解和碱式皂化后，将酯态甾醇、配糖类甾醇和酰基配糖类甾醇转化为游离态植物甾醇，萃取并配合现有的植物甾醇提取方法分别获得含对应游离态甾醇的提取物，通过高效液相色谱技术获得上述提取物的含量，并计算得到甘蔗样品中不同形式植物甾醇的含量。本发明专利技术方法选择盐酸-乙醇溶液和氢氧化钾-乙醇溶液的酸碱组合形式，确定适宜的反应条件，选择6-酮胆甾烷醇作为内标，乙醚作为萃取剂，并配合优化的高效液相色谱条件，显著提高了提取效率和检测的准确性。

【技术实现步骤摘要】
一种测定甘蔗中不同形式植物甾醇含量的方法
本专利技术涉及植物甾醇检测领域，尤其涉及一种测定甘蔗中不同形式植物甾醇含量的方法。
技术介绍
植物甾醇是自然界中的一类甾族化合物，属于饱和(或不饱和)的仲醇。植物甾醇因具有降胆固醇功效，近年来受到广泛的关注。此外，植物甾醇还具有抑制肿瘤、防治心脏病、抗癌、调节免疫功能的作用，被科学界誉为“生命的钥匙”。植物甾醇在甘蔗中主要以游离态(FS)和结合态存在，其中，结合态包括与脂肪酸结合成的酯(SE)、与糖类的羟基形成糖苷键的配糖类物质(SG)以及酰基配糖类化合物(ASG)。目前，甾醇的主要分析方法有称重法、高效液相色谱法、气相色谱法、毛细管电泳法等，但是，对于甘蔗中不同形式甾醇的检测方法还鲜有报道。2007年武晓云在其硕士论文中，利用皂化法对甘蔗糖厂滤泥中的植物甾醇进行了提取和测定，粗植物甾醇的提取率为8.4～15.5‰。目前国内大部分研究，针对甘蔗中植物甾醇提取方法进行研究，对植物甾醇含量精确测定鲜有报道。2009年韩军花等人利用气相色谱对50种常见食用植物药材及中草药植物中甾醇的含量进行测定。然而，利用气相色谱需对植物甾醇进行衍生化等操作，检测过程较繁琐。上述文献中测定甾醇含量的方法主要采用先进行甾醇提取，后对提取液进行测定的技术路线，造成提取的甾醇不完整，甾醇含量测定不准确，而且耗费较多溶剂和检测时间。此外，上述分析方法只包含碱式皂化，不能破坏糖苷键，SG或ASG因结合了葡萄糖分子而使其不能同时与FS溶解在非极性的萃取剂中，使得SG和ASG在测定中往往被低估。因此，有必要探究一种新的植物甾醇检测方法，以解决上述问题，实现不同形式植物甾醇含量的准确测定。
技术实现思路
本专利技术提供了一种测定甘蔗中不同形式植物甾醇含量的方法，该方法能够准确测定甘蔗中自由态和结合态植物甾醇的含量，具有提取率高、检测速度快、检测准确度高、溶剂消耗量少的特点。一种测定甘蔗中不同形式植物甾醇含量的方法，包括以下步骤：(1)通过乙醇浸提，从甘蔗粉末中提取得到游离态甾醇提取物；(2)通过碱式皂化反应，将甘蔗粉末中酯态甾醇转化为游离态甾醇，并萃取得到含游离态甾醇以及酯态甾醇对应当量甾醇的总提取物；(3)将甘蔗粉末置于酸性溶液中进行酸水解反应，再向酸解反应液中加入碱性溶液进行皂化反应，将甘蔗粉末中酯态甾醇、配糖类甾醇和酰基配糖类甾醇转化为游离态甾醇，并萃取得到含游离态甾醇以及酯态甾醇、配糖类甾醇和酰基配糖类甾醇对应当量甾醇的总提取物；(4)利用高效液相色谱技术测定步骤(1)～(3)中提取物的含量，计算得到甘蔗中酯态甾醇的含量以及糖类甾醇和酰基配糖类甾醇的总含量。酸式水解指利用盐酸乙醇溶液，通过水解反应破坏结合态甾醇中的糖苷键，使配糖类甾醇和酰基配糖类甾醇转化为游离态甾醇；碱式皂化指利用KOH乙醇溶液进行皂化反应，破坏结合态甾醇中的酯键，使酯态甾醇转化为游离态甾醇。步骤(1)中，乙醇浸提的温度为30℃，浸提时间为4小时，浸提过程中不断振荡频率为130次/min，以提高浸提效率和提取物含量。浸提结束后，过滤，收集滤液，蒸干后溶解在甲醇中，滤膜过滤待测。步骤(2)中，采用的碱性溶液为氢氧化钾-乙醇溶液，皂化反应的温度为70℃，时间为1h，并采用乙醚萃取，获得提取物。步骤(3)中，所述酸性溶液为盐酸-乙醇溶液，所述碱性溶液为氢氧化钾-乙醇溶液。通过实验发现，采用盐酸-乙醇溶液酸解、氢氧化钾-乙醇溶液皂化的组合方式获得的提取物的含量能更加接近真实值。所述甘蔗是指甘蔗的各组织，如：甘蔗皮、甘蔗茎、甘蔗节和甘蔗鞘，本专利技术方法适用于甘蔗单独的某一组织，也可适用于完整的甘蔗。为进一步提高提取效果，本专利技术对上述溶液的用量做了进一步优化，并得到最佳的反应条件。作为优选，所述盐酸-乙醇溶液的用量为32×10-3～48×10-3mol/g。所述氢氧化钾-乙醇溶液的用量为64×10-3～96×10-3mol/g。从实施例1、4、5可以看出，盐酸-乙醇溶液为40×10-3mol/g，氢氧化钾-乙醇溶液为80×10-3mol/g时，提取物的检测结果更接近真实值。作为优选，所述酸水解反应的温度为60～80℃，时间为1～1.5h；所述皂化反应的温度为70～90℃，时间为1～1.5h。经实验发现，酸水解反应与皂化反应的反应条件，尤其是反应温度，存在协同作用，只有适宜的条件组合下才能使最终测定结果更接近真实值，进一步优选，所述酸水解反应的温度为70℃，时间为1h；所述皂化反应的温度为70℃，时间为1h。采用内标法检测提取产物可提高检测的准确度，作为优选，步骤(3)中，酸性溶液中还添加有内标物，所述内标物为6-酮胆甾烷醇(6-ketocholestanol)。经实验发现，以5α-胆甾烷作为内标物时，5α-胆甾烷与杂质峰重合，导致植物甾醇浓度的低估；而采用6-酮胆甾烷醇作为内标物，出峰分离条件良好，回收率高，说明内标物的选择对待测提取物检测的准确性影响较大。作为优选，步骤(3)中，萃取过程采用的萃取剂为乙醚。虽然乙醚为常规萃取剂的一种，但不同萃取剂类型对提取效果以及最终的检测结果有影响，与内标物的类型也有关联。从实施例1和9中，可以发现，采用乙醚效果最佳。色谱条件的确定是决定检测结果优劣的另一重要因素，各条件参数的略微调整，对检测结果都有巨大影响，作为优选，步骤(4)中，高效液相色谱的条件为：色谱柱为Luan5μmC18，流动相为甲醇∶乙腈＝4∶1，1.2mL/min，进样量20μL，柱温30℃，检测波长210nm。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：(1)本专利技术方法将甘蔗样品中植物甾醇进行酸式水解和碱式皂化后，萃取获得含有游离态甾醇、酯态甾醇、配糖类甾醇和酰基配糖类甾醇的提取物，并配合现有的植物甾醇提取方法分别获得含游离态甾醇的提取物以及含游离态甾醇和酯态甾醇的提取物，通过高效液相色谱技术获得上述提取物的含量，并计算得到甘蔗样品中不同形式植物甾醇的含量。(2)本专利技术方法选择盐酸-乙醇溶液和氢氧化钾-乙醇溶液的酸碱组合形式，确定了先进行酸式水解，后进行碱式皂化的实验操作顺序，通过优化条件，确定最佳反应温度、反应时间和反应液用量，选择6-酮胆甾烷醇作为内标，乙醚作为萃取剂，并配合优化的高效液相色谱条件，显著提高了提取效率和检测的准确性。附图说明图1为实施例1甘蔗皮内各形式植物甾醇的HPLC检测图谱；A为游离态甾醇(FS)；B为游离态甾醇(FS)和酯态甾醇(SE)；C为游离态甾醇(FS)、酯态甾醇(SE)、配糖类甾醇(SG)和酰基配糖类甾醇(ASG)。图2为豆甾醇和β-谷甾醇的标准曲线。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步阐释，本实施例根据专利技术技术方案进行实施，给出了详细的实施方式和操作步骤，但本专利技术的保护范围并不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。本专利技术对步骤(1)～(3)均做了反应条件的优化，下列实施例中的步骤(1)和(2)为优化后的最佳反应条件。下列实施例中标准曲线的绘制方法，具体如下：分别称量6-酮胆甾烷醇，β-谷甾醇和豆甾醇的标准品，加入甲醇溶解，摇匀配制成质量浓度为1.0mg/mL的标准溶液；取各标准品溶液和6-酮胆甾烷醇加甲醇稀释，将6-酮胆甾烷醇作为内标，浓度控制在10μ本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种测定甘蔗中不同形式植物甾醇含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)通过乙醇浸提，从甘蔗粉末中提取得到游离态甾醇提取物；(2)通过碱式皂化反应，将甘蔗粉末中酯态甾醇转化为游离态甾醇，并萃取得到含游离态甾醇以及酯态甾醇对应当量甾醇的总提取物；(3)将甘蔗粉末置于酸性溶液中进行酸水解反应，再向酸解反应液中加入碱性溶液进行皂化反应，将甘蔗粉末中酯态甾醇、配糖类甾醇和酰基配糖类甾醇转化为游离态甾醇，并萃取得到含游离态甾醇以及酯态甾醇、配糖类甾醇和酰基配糖类甾醇对应当量甾醇的总提取物；(4)利用高效液相色谱技术测定步骤(1)～(3)中提取物的含量，计算得到甘蔗中酯态甾醇的含量以及糖类甾醇和酰基配糖类甾醇的总含量。

【技术特征摘要】
1.一种测定甘蔗中不同形式植物甾醇含量的方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)将红甘蔗的皮30℃干燥18h后直到质量不在发生变化，粉碎，过筛，获得60目的甘蔗粉末；取1g的甘蔗粉末加入到10mL的乙醇中进行浸提，再加入120μg6-酮胆甾烷醇作为内标，30℃下，130次/min振荡浸提液4h，过滤，收集滤液，蒸干后，溶解在10mL的甲醇中，用0.45μm滤膜过滤，获得含游离态甾醇的第一提取物；(2)将红甘蔗的皮30℃干燥18h后直到质量不在发生变化，粉碎，过筛，获得60目的甘蔗粉末；取0.5g的甘蔗粉末加入到5mL4.0mol/L的KOH乙醇溶液中进行皂化，再加入120μg6-酮胆甾烷醇作为内标，70℃回流皂化1h后，用10mL乙醚提取两次，收集乙醚层，并用蒸馏水洗至中性，用无水NaSO4除水，蒸干后溶解在25mL甲醇中，用0.45μm滤膜过滤，获得含游离态甾醇和酯态甾醇的第二提取物；(3)将红甘蔗的皮30℃干燥18h后直到质量不在发生变化，粉碎，过筛，获得60目的甘蔗粉末；取0.5g的甘蔗粉末加入到5mL4.0mol/L的HCl乙醇溶...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗自生，冯思敏，张炎冰，钟舟，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33