miR-320a-3p作为内参基因在法医体液鉴定中的应用制造技术

本发明专利技术公开了miR

【技术实现步骤摘要】
miR
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320a
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3p作为内参基因在法医体液鉴定中的应用


[0001]本专利技术属于法医学领域，具体涉及miR
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320a
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3p作为内参基因在法医体液鉴定中的应用。

技术介绍

[0002]基于miRNA的体液鉴定方法在法医学实践中发挥着重要作用，在使用相对定量法检测目标miRNA表达量时，需要科学准确地选择内参基因。微RNA(microRNA，miRNA)是一种长度为18
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25个核苷酸的非编码小分子RNA。miRNA具有稳定性高、保守性强、灵敏度高、组织特异性好、可兼容DNA同步分析等优点，已成为法医学体液鉴定的重要替代工具。
[0003]定量逆转录PCR(quantitative reverse transcription PCR，RT
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qPCR)被广泛用于确定候选基因的表达水平，通常被认为是基因表达定量的金标准。然而，为了提供可靠的、可重复的、具有生物学意义的目标分子数量，RT
‑
qPCR必须对非生物学差异进行稳健和严格的归一化；尤其是在大多数法医环境中，为了抵消从不同个体、体液类型和时间进程中所获得样本的明显的非生物学差异，使用合适的和经过验证的内源性参照基因尤为重要。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供更稳定的用于法医体液鉴定的内参基因。
[0005]本专利技术首先保护miR
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320a
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3p，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0006]本专利技术还保护所述miR
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320a
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3p作为内参基因在鉴定人体液的组织来源中的应用。
[0007]上述应用中，所述人体液的组织来源可为外周血、月经血、唾液、精液或阴道分泌液。
[0008]上述应用中，所述应用用于非疾病的诊断与治疗。
[0009]本专利技术还保护内参基因组合，其由miR
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320a
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3p和RNU6b组成；
[0010]miR
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320a
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3p的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
[0011]RNU6b的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
[0012]本专利技术还保护所述内参基因组合在鉴定人体液的组织来源中的应用。
[0013]上述应用中，所述人体液的组织来源可为外周血、月经血、唾液、精液或阴道分泌液。
[0014]上述应用中，所述应用用于非疾病的诊断与治疗。
[0015]本专利技术以五种法医常见体液(即精液、外周血、月经血、唾液、阴道分泌液)为研究对象，通过对37个样本的高通量测序和分析筛选出28个候选内参基因，并通过RT
‑
qPCR检测其在15份样本中表达水平。通过RefFinder综合4种常用算法(geNorm、NormFinder、BestKeeper和ΔCq方法)，对一组10个相对稳定的候选内参基因在100份样本中的稳定性进行评价。此外，制备室外和室内放置不同时间的模拟降解样本共56份以进一步评价候选内参基因在不同条件下的稳定性。最后，检测目前已有的体液特异性miRNA在30份样本中的相
对表达量，以验证内参基因的实用性和有效性。经4种算法稳定性综合排序，miR
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320a
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3p是五种法医相关体液中表达最稳定的内参基因，其与RNU6b的组合增强了归一化效力。当检测体液特异性miRNA时，miR
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320a
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3p与RNU6b具有相似的归一化效果。本研究通过确定合适的内参基因以进行严格的归一化，可以促进基于miRNA的体液鉴定的发展和应用。本研究是目前为止对于miRNA体液鉴定中内参基因进行的最为系统性的研究，能够为后续相关研究在内参基因的选择上提供有价值的信息。本专利技术具有重要的应用价值。
附图说明
[0016]图1为实验设计及样本分布方案。
[0017]图2为基于五种体液中Cq均值的候选内参RNA表达谱热图。
[0018]图3为候选内参基因在5种体液中基于4种算法的稳定性值。
[0019]图4为基于4种算法排序值几何平均数(GRV)的综合稳定性排序。
[0020]图5为候选内参基因在室外降解样本中的表达量。
具体实施方式
[0021]下面结合具体实施方式对本专利技术进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本专利技术，而不是为了限制本专利技术的范围。以下提供的实施例可作为本
普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本专利技术的限制。
[0022]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0023]实施例、
[0024]一、材料和方法
[0025]1、样本的采集
[0026]样本均采集于健康志愿者。其中外周血(PB)样本通过静脉穿刺收集入EDTA抗凝采血管内；唾液(SA)样本(收集前禁食1h)通过无菌塑料管收集；精液(SE)样本(收集前，志愿者禁欲2天)通过无菌广口塑料杯收集；不含精液的阴道分泌液(VA)样本通过收集卫生棉条获取；不含精液的月经血(MB)(月经周期的第2或3天)样本通过收集卫生棉条获取。
[0027]所有样本室温晾干1天，
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80℃储存备用。
[0028]本研究共检测了238份样本，样本分布方案如图1所示。
[0029]样本采集由公安部物证鉴定中心伦理委员会审查通过，所有志愿者均已签署知情同意书。
[0030]2、RNA的提取和定量
[0031]取步骤1采集的样本，使用miRNeasy Mini Kit(Qiagen，德国)提取总RNA，得到样本的总RNA。
[0032]使用NanoDrop 2000c分光光度计(Thermo Fisher Scientific，美国)检测样本的总RNA的浓度和纯度(OD
260
/
280
)。
[0033]3、高通量miRNA测序
[0034]对37份样本(包括5份外周血样本、7份月经血样本、5份唾液样本、13份精液样本和
7份阴道分泌液样本)进行高通量测序。具体步骤如下：将样本的总RNA通过PAGE电泳进行分离纯化，切除标记道上18
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30nt条带对应的小RNA区域并回收，然后连接一个5
’
接头和一个3
’
接头，并逆转录成cDNA。使用高敏聚合酶对cDNA进行扩增，富集同时连接有3
’
接头和5
’
接头的cDNA，放大文库产量，使用PAGE电泳分离出100
‑
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.miR
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320a
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3p，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。2.权利要求1所述miR
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320a
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3p作为内参基因在鉴定人体液的组织来源中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述人体液的组织来源为外周血、月经血、唾液、精液或阴道分泌液。4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：所述应用用于非疾病的诊断与治疗。5.内参基因组合，由miR
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【专利技术属性】
技术研发人员：孙启凡，胡胜，季安全，赵一霞，魏孙祥，陈惠香，王哲，
申请(专利权)人：公安部物证鉴定中心，
类型：发明
国别省市：