本发明专利技术公开了一种检测25-羟基维生素D3含量的试剂盒及其制备方法和应用。所述试剂盒由彼此独立的试剂Ⅰ和试剂Ⅱ组成；其中，试剂Ⅰ的组分包括：25-羟基维生素D3-BSA偶联物、生物缓冲剂、螯合剂、表面活性剂、促凝剂、防腐剂、稳定剂和水；试剂Ⅱ的组分包括：包被25-羟基维生素D3抗体的胶乳颗粒、生物缓冲剂、螯合剂、表面活性剂、助悬剂、防腐剂、封闭剂、稳定剂和水。本发明专利技术试剂盒检测灵敏度高，特异性强，定量准确，线性范围宽，尤其适用于25-羟基维生素D3含量极低样品的检测。此外，本发明专利技术试剂盒在检测过程中不需对样本进行预稀释，方便临床使用，操作简单、检测成本低，适用于各种全自动生化分析仪。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种检测人体内25-羟基维生素D3含量的试剂盒及其制备方法，本专利技术还涉及该25-羟基维生素D3测定试剂盒在检测人体内25-羟基维生素D3含量的使用方法，属于25-羟基维生素D3含量的检测领域。
技术介绍
25-羟基维生素D3是人体内存储维生素D的主要形式之一，它是人体正常代谢活动不可或缺的物质之一。总体而言，全球三分之二的人缺乏维生素D，其中，在儿童、老人和孕妇中更容易出现维生素D缺乏的现象。体内维生素D的缺乏，使儿童患佝偻病和老人患骨质疏松症的可能性大大增加。近年来大量研究表明，维生素D的缺乏直接影响到人体内肿瘤的发生，特别是结肠癌、乳腺癌和前列腺癌；目前，维生素D的缺乏已被证实为判别腺癌发生的重要标志物，在临床诊断上将成为一项重要的指标。此外，维生素D的缺乏还与自身免疫性疾病、感染性疾病和心血管疾病等的发生有着密切的关系。目前，临床上对维生素D的定量检测已成为常规检测项目和体检项目。为此，建立一种快速、简便、灵敏、准确可靠的检测维生素D水平的方法尤为重要。近几年来，25-羟基维生素D3的定量检测主要有理化检验方法和免疫学方法。理化检验方法主要有液相色谱-质谱联用技术(LC-MS)；免疫学方法主要有放射免疫法(RIA)和酶联免疫吸附法(ELISA)。液相色谱-质谱联用(LC-MS)的检测方法虽然灵敏度高，但是存在仪器昂贵、样品前处理复杂、操作繁琐、检测时间长等诸多弊端。放射免疫法虽然存在操作简单、特异性强、灵敏度高等优势，但是同样存在着辐射污染以及稳定性差等方面的缺陷。酶联免疫吸附法(ELISA)虽然准确、灵敏度高，但是存在操作要求严格且费时等缺陷，不适用于急诊和临床病人及时诊断和治疗的需要。迄今为止，尚缺乏一种操作简单快速、定量准确、敏感度高或特异性强的用于检测人体内25-羟基维生素D3含量的试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种25-羟基维生素D3检测试剂盒；本专利技术的目的之二是提供一种制备所述25-羟基维生素D3检测试剂盒的方法。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案来实现的一种检测25-羟基维生素D3含量的试剂盒，由彼此独立的试剂I和试剂II组成；其中，试剂I的组分包括25-羟基维生素D3-BSA偶联物、生物缓冲剂、螯合剂、表面活性齐U、促凝剂、防腐剂、稳定剂和水；试剂II的组分包括包被25-羟基维生素D3抗体的胶乳颗粒、生物缓冲剂、螯合齐U、表面活性剂、助悬剂、防腐齐U、封闭齐U、稳定剂和水。本专利技术发现，试剂I或试剂II中各组分的用量对于检测的准确度、灵敏度及特异性均有着非常显著的影响；本专利技术通过大量的优选试验最终筛选到了试剂I或试剂II中各组分的最佳用量，采用下述这些优选的用量能够有效提高检测结果的准确度、灵敏度及特异性每I升试剂I中各组分的用量优选为25-羟基维生素D3-BSA偶联物0. 05_50mg，生物缓冲剂l-100g，螯合剂0. l-10g，表面活性剂0. l_5mL，防腐剂0. l_10g，稳定剂l_50g，促凝剂l_50g，余量为水；进一步优选的，每I升试剂I中各组分的用量为25_羟基维生素D3-BSA偶联物0. l-30mg,生物缓冲剂5-50g，螯合剂0. 5_5g，表面活性剂0. 5_4mL，防腐剂0. 5_5g，稳定剂10-40g，促凝剂10-40g，余量为水；更进一步优选的，每I升试剂I中各组分的用量为25_羟基维生素D3-BSA偶联物0. 5-20mg,生物缓冲剂10_20g，螯合剂0. 7_2g，表面活性剂0. 7_2mL，防腐剂0. 6-1. 5g，稳定剂15-30g，促凝剂12-30g，余量为水；最优选的，每I升试剂I中各组分的用量为25-羟基维生素D3-BSA偶联物5mg，生物缓冲剂12g，螯合剂lg，表面活性剂0. 5mL，防腐剂lg，稳定剂20g，促凝剂15g，余量为水；每I升试剂II中各组分的用量优选为包被25-羟基维生素D3抗体的胶乳颗粒0. l-10g，生物缓冲剂l-100g，螯合剂0. l-10g，表面活性剂0. 1-lOmL，防腐剂0. l_10g，助悬剂5-50mL，封闭剂5-50g，稳定剂50_150g，余量为水。进一步优选的，每I升试剂II中各组分的用量为包被25-羟基维生素D3抗体胶乳颗粒0. 5-5g，生物缓冲剂5-40g，螯合剂0. 5-5g，表面活性剂l_7mL，防腐剂0. 5_5g，助悬剂10-40mL，封闭剂6-30g，稳定剂80_140g，余量为水。更进一步优选的，每I升试剂II中各组分的用量为包被25-羟基维生素D3抗体胶乳颗粒0. 8-3g，生物缓冲剂8-15g，螯合剂l-3g，表面活性剂l_4mL，防腐剂0. 7_2g，助悬剂15-30mL，封闭剂8-15g，稳定剂90_120g，余量为水。最优选的，每I升试剂II中各组分的用量为包被25-羟基维生素D 3抗体胶乳颗粒1. 8g，生物缓冲剂10. 5g，螯合剂2g，表面活性剂3mL，防腐剂lg，助悬剂20mL，封闭剂10g，稳定剂100g，余量为水。为了实现更好的检测效果，试剂I的pH值的范围优选为7. 0-8.0，试剂II的pH值的范围优选为6. 5-7.5。本专利技术试剂II中所述的“包被25-羟基维生素D3抗体的胶乳颗粒”是在磷酸盐缓冲液中将25-羟基维生素D3抗体通过物理吸附或化学交联等方法结合到羧化改性聚苯乙烯胶乳颗粒的表面，再经过离心、洗涤后所得；其中，所述的25-羟基维生素D3抗体可以是25-羟基维生素D3单克隆抗体或多克隆抗体。可以通过物理吸附或化学交联的方法将25-羟基维生素D3抗体结合聚苯乙烯胶乳颗粒的表面。物理吸附的抗体在长时间放置后，抗体蛋白容易解吸附，导致检测灵敏度降低，重复性较差。本专利技术优选采用通过化学交联的方法将25-羟基维生素D3抗体结合到羧化改性聚苯乙烯胶乳颗粒的表面，这样能够使结合的抗体更加稳定。优选的，一种制备包被25-羟基维生素D3单克隆抗体或多克隆抗体胶乳颗粒的方法，包括以下步骤①将聚苯乙烯胶乳颗粒用磷酸盐缓冲液分散，再加入6-氨基己酸溶液和1-乙基-3- (3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)，搅拌均匀后，离心弃上清；再用磷酸盐缓冲液稀释分散沉淀胶乳得到羧化改性聚苯乙烯胶乳溶液；②将25-羟基维生素D3单克隆抗体或多克隆抗体冻干品用去离子水溶解，制成抗体溶液；③取抗体溶液，用磷酸盐缓冲液稀释后，加入步骤①所制备的羧化改性聚苯乙烯胶乳溶液，再加入EDC，在0-4°C搅拌反应，加入甘氨酸缓冲液搅拌，终止反应，离心弃上清，用磷酸盐缓冲液洗涤沉淀，得到包被25-羟基维生素D3抗体胶乳颗粒。试剂I或试剂II中所述的生物缓冲剂主要是起到中和酸碱的作用，所以能够起到中和酸碱作用的各种缓冲剂均能够适用于本专利技术的生物缓冲剂，例如可以是三羟甲基氨基甲烷(Tris)、三羟甲基甲胺基乙磺酸(TES)、2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)、N-(2-羟乙基)哌嗪-N' -2-乙烷磺酸(HEPES)、三羟甲基甲胺基丙磺酸(TAPS)、哌嗪-1,4-二羟基丙磺酸(P0PS0)、3- (N-吗啉)丙磺酸(MOPS)等各种常用生物缓冲液，为了达到更好的检测效果，试剂I中所述的生物缓冲剂优选为三羟甲基氨基甲烷，试剂II中所述的生物本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测25?羟基维生素D3含量的试剂盒，其特征在于：由彼此独立的试剂Ⅰ和试剂Ⅱ组成；其中，试剂Ⅰ的组分包括：25?羟基维生素D3?BSA偶联物、生物缓冲剂、螯合剂、表面活性剂、促凝剂、防腐剂、稳定剂和水；试剂Ⅱ的组分包括：包被25?羟基维生素D3抗体的胶乳颗粒、生物缓冲剂、螯合剂、表面活性剂、助悬剂、防腐剂、封闭剂、稳定剂和水。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：华权高，沈鹤霄，许可，闫彩霞，常向博，舒芹，余箭翔，
申请(专利权)人：武汉华美生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：
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