本发明专利技术公开了一种同时检测血液中维生素A和25‑羟基维生素D的方法，包括以下步骤：(一)将全血样本离心，取上清液得血清或血浆，备用；(二)标准溶液的标定；(三)样品前处理；(四)取步骤(三)中处理后的待测上清液样品80μL放入自动进样瓶中经液相色谱串联质谱法进行分析，同时定量检测血液中维生素A和25‑羟基维生素D的含量。本发明专利技术所述的同时检测血液中维生素A和25‑羟基维生素D的方法，特异性强、准确度和灵敏度高、分析时间短。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及维生素检测
，尤其涉及一种同时检测血液中维生素A和25-羟基维生素D的方法。
技术介绍
维生素A(VA)是脂溶性的醇类物质，有多种分子形式，是最早被发现的维生素，其中维生素A1(VA1)主要存在于动物肝脏、血液和眼球的视网膜中，又叫视黄醇，熔点64℃，分子式C20H30O，见化学结构式(1)；维生素A2(VA2)主要在淡水鱼中存在，熔点只有17～19℃，分子式C20H28O，又称视黄醛。维生素A是构成视觉细胞中感受弱光的视紫红质的组成成分，人体缺乏维生素A，影响暗适应能力，如儿童发育不良、皮肤干燥、干眼病、夜盲症，老年斑等。维生素D(vitaminD，简称VD)为固醇类衍生物，具抗佝偻病作用，又称抗佝偻病维生素。目前认为VD也是一种类固醇激素。VD均为不同的维生素D原(动物皮下的7-脱氢胆固醇，酵母细胞中的麦角固醇都是维生素D原)经紫外照射后的衍生物。VD家族成员中最重要的成员也是对健康关系较密切的D2(麦角钙化醇)和VD3(胆钙化醇)。它们有以下三点特性：它存在于部分天然食物中；人体皮下储存有从胆固醇生成的7-脱氢胆固醇，受紫外线的照射后，可转变为VD3。适当的日光浴足以满足人体对VD的需要，从食物中得来的VD，与脂肪一起吸收，吸收部位主要在空肠与回肠，胆汁帮助其吸收。吸收的VD与乳糜微粒相结合，由淋巴系统运输，但也可与VD运输蛋白(α-球蛋白部分)相结合在血浆中运输，有些与β-脂蛋白相结合，当VD运到肝脏中，在微粒体中经单氧酶系统作用，将其25位羟基化形成25-羟基维生素D(25-hydroxyvitaminD，简称25-(OH)VD)，肝外的其他组织也可吸取VD及25-(OH)VD，因此组织中VD及25-(OH)VD及其总量比血浆中多。血浆中25-(OH)VD3在注射后1～3天达到高峰，其浓度可达到20～40ng/ml，最高可达80ng/ml。浓度与摄入量有一定的关系，小于4ng/ml，临床上可发生佝偻病及骨质软化。25-OH-VD3的经验分子式(希尔表示法)是C27H44O2，分子量400.64，见化学结构式(2)。25-OH-VD2的经验分子式(希尔表示法)是C28H44O2，分子量412.65，见化学结构式(3)。目前，测定维生素的方法包括分光光度法、层析法、气相色谱法、高效液相色谱法和液相色谱一串联质谱法等，其中，液相色谱法为测定维生素的首选方法。现有技术中对维生素的检测多采用高效液相色谱(HPLC)分离后与多波长吸收或联合吸收或荧光吸收相结合的检测方法，现有色谱方法或液相质谱检测方法存在特异性差、样品处理复杂导致样本处理期间维生素含量的变化、分析时间长，方法特异性差，整个检测过程时间长的问题，且用液相色谱一串联质谱法同时检测血液中维生素A和25-羟基维生素D文献很少。
技术实现思路
针对上述技术问题，本专利技术的目的是提供一种同时检测血液中维生素A和25-羟基维生素D的方法，采用液相色谱串联质谱法同时测定血液中维生素A和25-羟基维生素D，该方法特异性强、准确度和灵敏度高、分析时间短。本专利技术采用的技术方案是：一种同时检测血液中维生素A(视黄醇)和25-羟基维生素D的方法，包括如下步骤：(一)将全血样本离心，取上清液得血清或血浆，备用；(二)标准溶液的标定：三个以上浓度的标准品的混合标准工作液200ul分别和10ul混合内标工作液涡旋混匀，制作标准曲线系列溶液；所述标准曲线系列溶液在检测前必须进行紫外分光光度计重新标定维生素A(视黄醇)的准确浓度；所述标准品为视黄醇、25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3，所述混合内标工作液为维生素A同位素内标和25-羟基维生素D同位素内标的混合液；(三)样品前处理：(1)精密移取步骤(二)中所述混合内标工作液加入到步骤(一)中所述血清或血浆中，涡旋混匀；(2)再加入纯水或甲酸水稀释后加入乙醇、甲醇或乙腈溶液，涡旋混匀后高速离心；(3)再加入正己烷萃取，涡旋混匀后离心；(4)然后取上清液后常温N2吹干；(5)加复溶液，涡旋混匀，超声，高速离心后取上清液样品待测；(四)取步骤(三)中处理后的待测上清液样品80μL放入自动进样瓶中经液相色谱串联质谱法进行分析，同时定量检测血液中维生素A和25-羟基维生素D的含量；液相色谱条件：色谱柱：ZORBAXXDBC82.1*50mm5μm；等度或梯度洗脱：流动相为甲醇和水，甲醇和水均含体积比为0.1％甲酸分析时间：4min；柱温：25℃；进样量：20μl；流速:0.35ml/min；串联质谱条件：采用电喷雾离子源ESI或大气压化学离子源APCI，正离子模式，选择反应监测模式，雾化气温度：350℃；雾化气气流：6L/min；雾化气压：35psi；毛细管电压：4500v；DeltaEMV(+):300。本专利技术所述的同时检测血液中维生素A(视黄醇)和25-羟基维生素D的方法，其中，步骤(二)中25-羟基维生素D包括25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3，所述视黄醇、25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3的同位素内标分别为[2H3]视黄醇、[2H3]25-OH-VD2和[2H6]25-OH-VD3。本专利技术所述的同时检测血液中维生素A(视黄醇)和25-羟基维生素D的方法，其中，步骤(三)中所述血清、乙醇和正己烷的体积比为1：1：6。本专利技术所述的同时检测血液中维生素A(视黄醇)和25-羟基维生素D的方法，其中，步骤(二)中标准溶液的标定，包括以下步骤：(1)维生素A的标准工作液的制备：制备浓度分别为0.014mg/L、0.028mg/L、0.056mg/L、0.113mg/L、0.225mg/L、0.45mg/L和0.90mg/L的维生素A标准工作液；(2)25-羟基维生素D的标准工作液的制备：25-OH-VD2的浓度分别为1.5ng/ml，2.5ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml，40ng/ml，80ng/ml，160ng/ml和320ng/ml；25-OH-VD3的浓度分别为1.5ng/ml，2.5ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml，40ng/ml，80ng/ml，160ng/ml和320ng/ml；(3)混合内标工作液的配制：制备含有400ng/ml的[2H3]视黄醇、73.5ng/ml的[2H3]25-OH-VD2和108.5ng/ml的[2H6]25-OH-VD3混合内标工作液。本专利技术所述的同时检测血液中维生素A(视黄醇)和25-羟基维生素D的方法，其中，步骤(四)中所述流动相中甲醇和水的体积比为87：13。本专利技术所述的同时检测血液中维生素A(视黄醇)和25-羟基维生素D的方法，其中，步骤(5)中所述复溶液为甲醇、乙醇或乙腈。本专利技术所述的同时检测血液中维生素A(视黄醇)和25-羟基维生素D的方法，其中，步骤(一)中离心速度为3500-4000r/min，离心时间为10-15min。本专利技术所述的同时检测血液中维生素A(视黄醇)和25-羟基维生素D的方法，特异性强、准确度和灵敏度高、前处理过程简单且仪器分析时间短，为临床上诊断血液中维生素A和维生素D的缺乏或过量提供了可靠的实验依本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种同时检测血液中维生素A和25‑羟基维生素D的方法，其特征在于：包括如下步骤：(一)将全血样本离心，取上清液得血清或血浆，备用；(二)标准溶液的标定：三个以上浓度的标准品的混合标准工作液200ul分别和10ul混合内标工作液以涡旋混匀，制作标准曲线系列溶液；所述标准曲线系列溶液在检测前必须进行紫外分光光度计重新标定维生素A的准确浓度；所述标准品为视黄醇、25‑羟基维生素D2和25‑羟基维生素D3，所述混合内标工作液为维生素A同位素内标和25‑羟基维生素D同位素内标的混合液；(三)样品前处理：(1)精密移取步骤(二)中所述混合内标工作液加入到步骤(一)中所述血清或血浆中，涡旋混匀；(2)再加入纯水或甲酸水稀释后加入乙醇、甲醇或乙腈溶液，涡旋混匀后高速离心；(3)再加入正己烷萃取，涡旋混匀后离心；(4)然后取上清液后常温N2吹干；(5)加复溶液，涡旋混匀，超声，高速离心后取上清液样品待测；(四)取步骤(3)中处理后的待测上清液样品80μL放入自动进样瓶中经液相色谱串联质谱法进行分析，同时定量检测血液中维生素A和25‑羟基维生素D的含量；液相色谱条件：色谱柱：ZORBAX XDB C82.1*50mm 5μm；等度或梯度洗脱：流动相为甲醇和水，甲醇和水均含体积比为0.1％甲酸分析时间：4min；柱温：25℃；进样量：20μl；流速:0.35ml/min；串联质谱条件：采用电喷雾离子源ESI或大气压化学离子源APCI，正离子模式，选择反应监测模式，雾化气温度：350℃；雾化气气流：6L/min；雾化气压：35psi；毛细管电压：4500v；Delta EMV(+):300。...
【技术特征摘要】
1.一种同时检测血液中维生素A和25-羟基维生素D的方法，其特征在于：包括如下步骤：(一)将全血样本离心，取上清液得血清或血浆，备用；(二)标准溶液的标定：三个以上浓度的标准品的混合标准工作液200ul分别和10ul混合内标工作液以涡旋混匀，制作标准曲线系列溶液；所述标准曲线系列溶液在检测前必须进行紫外分光光度计重新标定维生素A的准确浓度；所述标准品为视黄醇、25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3，所述混合内标工作液为维生素A同位素内标和25-羟基维生素D同位素内标的混合液；(三)样品前处理：(1)精密移取步骤(二)中所述混合内标工作液加入到步骤(一)中所述血清或血浆中，涡旋混匀；(2)再加入纯水或甲酸水稀释后加入乙醇、甲醇或乙腈溶液，涡旋混匀后高速离心；(3)再加入正己烷萃取，涡旋混匀后离心；(4)然后取上清液后常温N2吹干；(5)加复溶液，涡旋混匀，超声，高速离心后取上清液样品待测；(四)取步骤(3)中处理后的待测上清液样品80μL放入自动进样瓶中经液相色谱串联质谱法进行分析，同时定量检测血液中维生素A和25-羟基维生素D的含量；液相色谱条件：色谱柱：ZORBAXXDBC82.1*50mm5μm；等度或梯度洗脱：流动相为甲醇和水，甲醇和水均含体积比为0.1％甲酸分析时间：4min；柱温：25℃；进样量：20μl；流速:0.35ml/min；串联质谱条件：采用电喷雾离子源ESI或大气压化学离子源APCI，正离子模式，选择反应监测模式，雾化气温度：350℃；雾化气气流：6L/min；雾化气压：35psi；毛细管电压：4500v；DeltaEMV(+):300。2.根据权利要求1所述的同时检测血液中维生素A和25-羟基维生素D的方法，其特征在于：步骤(二)中25-羟基维生素D包括25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3，所述视黄醇、25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3的同位素内标分别为[2H3]...
【专利技术属性】
技术研发人员：倪君君，李玮，
申请(专利权)人：北京和合医学诊断技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。