一种同时测定大青叶中11种有效成分含量的方法技术

本发明专利技术公开了一种同时测定大青叶中11种有效成分含量的方法，该方法采用高效液相色谱法，利用C18色谱柱，以水和甲醇为流动相，梯度洗脱，洗脱程序为：0～6min，5％甲醇；6～20min，5％～14％甲醇；20～30min，14％～25％甲醇；30～65min，25％～50％甲醇；65～75min，50％～75％甲醇；75～85min，75％～95％甲醇，可同时测定大青叶中11种有效成分：胞苷、尿苷、腺嘌呤、鸟苷、腺苷、松柏苷、4(3H)‑喹唑酮、槲皮素、色胺酮、靛蓝和靛玉红的含量。本发明专利技术方法简单、准确、重现性和稳定性良好，且11种有效成分均能获得有效分离，可以较为全面地反映大青叶药材的品质特征，适用于该药材的质控评价。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于中药成分分析
，具体涉及一种利用高效液相色谱法同时测定大青叶中11种有效成分含量的方法。
技术介绍
大青叶为十字花科(Cruciferae)菘蓝属(Isatis)两年生草本植物菘蓝(IsatisindigoticaFort.)的干燥叶，是常见的大宗药材之一，主要分布于陕西、甘肃、河北、江苏等地。大青叶的有效成分主要包括核苷、生物碱、有机酸等，核苷类成分，具有活血化瘀之功效，4(3H)-喹唑酮、色胺酮、靛玉红等是抗病毒的有效成分，松柏苷和槲皮素具有抗氧化活性，靛蓝主要作为色素染料。《中华人民共和国药典·一部》(2015版)仅对大青叶中靛玉红的含量进行了考察，并未对其所含有的其他有效成分进行描述和评价，对于科学评价大青叶药材品质具有一定的局限性。大青叶含有多种有效成分，若能通过简单、快速、高效的方法同时测定多种有效成分，如胞苷、尿苷、腺嘌呤、鸟苷、腺苷、松柏苷、4(3H)-喹唑酮、槲皮素、色胺酮、靛蓝、靛玉红等的含量，将有助于全面、准确地评价大青叶药材质量，为其规范化栽培和生产提供合理依据。已有研究人员分别对大青叶中黄酮类物质、核苷类物质、脂肪酸类物质的含量进行了测定，但同时测定大青叶中核苷类和生物碱类物质，包括胞苷、尿苷、腺嘌呤、鸟苷、腺苷、松柏苷、4(3H)-喹唑酮、槲皮素、色胺酮、靛蓝、靛玉红等11种有效成分的含量测定尚无文献报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种同时测定大青叶中11种有效成分含量的方法，进而比较不同产区大青叶在化学成分组成及含量上存在的异同，为大青叶药材的品质鉴定及质量控制提供参考。解决上述技术问题所采用的技术方案由下述步骤组成：1、制备11种有效成分的对照品溶液，所述的11种有效成分为胞苷、尿苷、腺嘌呤、鸟苷、腺苷、松柏苷、4(3H)-喹唑酮、槲皮素、色胺酮、靛蓝和靛玉红。2、利用高效液相色谱法对步骤1中的对照品溶液进行分析，色谱条件为：采用C18色谱柱，以水和甲醇为流动相，梯度洗脱，洗脱程序为：0～6min，5％甲醇；6～20min，5％～14％甲醇；20～30min，14％～25％甲醇；30～65min，25％～50％甲醇；65～75min，50％～75％甲醇；75～85min，75％～95％甲醇；以峰面积值为纵坐标、对照品含量为横坐标，绘制各对照品的峰面积值随含量变化的标准曲线。3、制备大青叶供试品溶液。4、按照步骤2的色谱条件对大青叶供试品溶液进行分析，通过标准曲线法计算大青叶供试品溶液中胞苷、尿苷、腺嘌呤、鸟苷、腺苷、松柏苷、4(3H)-喹唑酮、槲皮素、色胺酮、靛蓝和靛玉红的含量。上述步骤3中，优选制备大青叶供试品溶液的方法为：将大青叶经50℃烘干后粉碎过40目筛，所得药材粉末与体积分数为65％的甲醇水溶液按料液比为1g:30mL混合，30℃超声提取30min，离心分离，上清液过0.22μm微孔滤膜，即得大青叶供试品溶液。上述方法中，进一步优选C18色谱柱为ThermoC18色谱柱，检测柱温为25～35℃，检测波长为254～270nm，流动相的流速为1.0mL/min。本方法以甲醇-水为流动相，应用梯度洗脱的方法，建立了同时测定大青叶中11种有效成分的方法，该方法操作简单、准确、重现性和稳定性良好，11种有效成分均能获得有效分离，可为全面评价和控制大青叶药材质量提供有效参考。附图说明图1是11种对照品的色谱图，其中1是胞苷、2是尿苷、3是腺嘌呤、4是鸟苷、5是腺苷、6是松柏苷、7是4(3H)-喹唑酮、8是槲皮素、9是色胺酮、10是靛蓝、11是靛玉红。图2是10个产区的大青叶供试品溶液的色谱图。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术进一步详细说明，但本专利技术的保护范围不仅限于这些实施例。实施例1本实施例采用高效液相色谱法同时测定10个不同产地的大青叶中的11种有效成分的含量，其11种有效成分为胞苷、尿苷、腺嘌呤、鸟苷、腺苷、松柏苷、4(3H)-喹唑酮、槲皮素、色胺酮、靛蓝和靛玉红；大青叶于2015年7月收集自陕西渭南、陕西商洛、陕西西安、河南辉县、河北安国、安徽亳州、甘肃甘谷、江苏无锡、湖南长沙、山东菏泽10个产区，具体测试方法如下：1、制备11种有效成分的对照品溶液精密称取胞苷(西玛实验室，批号：0715)、尿苷(中国药品生物制品检定所，批号：887-200202)、腺嘌呤(西玛实验室，批号：07S15)、鸟苷(西玛实验室，批号：09S14)、腺苷(中国药品生物制品检定所，110879-200202)、松柏苷(西玛实验室，批号：05W16)、4(3H)-喹唑酮(西玛实验室，批号：01A16)、槲皮素(中国药品生物制品检定所，100081-200907)对照品各5.0mg，分别置于5mL容量瓶中，以色谱甲醇溶解并定容；精密称取色胺酮(西玛实验室，批号：07S15)、靛蓝(中国药品生物制品检定所，批号：MUST-13031101)、靛玉红(中国药品生物制品检定所，批号：110717-200204)对照品各2.0mg，分别置于5mL容量瓶中，以少量二甲基亚砜助溶，并以色谱甲醇定容。将上述溶液分别稀释100、100、50、50、25、100、100、100、20、20、20倍，0.22μm微孔滤膜过滤，即得0.01mg/mL胞苷、0.01mg/mL尿苷、0.02mg/mL腺嘌呤、0.02mg/mL鸟苷、0.04mg/mL腺苷、0.01mg/mL松柏苷、0.01mg/mL4(3H)-喹唑酮、0.01mg/mL槲皮素、0.02mg/mL色胺酮、0.02mg/mL靛蓝和0.02mg/mL靛玉红对照品溶液。2、利用高效液相色谱仪(Agilent公司，型号：1260)对步骤1中的11种对照品溶液分别进行分析，色谱条件为：采用ThermoC18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，以水和甲醇(色谱纯)为流动相进行梯度洗脱，流速为1.0mL/min，柱温30℃，检测波长260nm，洗脱程序为：0～6min，5％甲醇；6～20min，5％～14％甲醇；20～30min，14％～25％甲醇；30～65min，25％～50％甲醇；65～75min，50％～75％甲醇；75～85min，75％～95％甲醇；11种对照品溶液均分别以1μL、5μL、10μL、15μL、20μL体积进样，以峰面积值为纵坐标、样品含量为横坐标，绘制各对照品的峰面积值随含量变化的标准曲线，得到表1所示的线性回归方程。表1线性关系试验结果(n＝3)同时以甲醇为溶剂，配制11种有效成分的混合液，混合液中胞苷的浓度为0.025mμg/mL、尿苷的浓度为0.0163mg/mL、腺嘌呤的浓度为0.0163mg/mL、鸟苷的浓度为0.025mg/mL、腺苷的浓度为0.015mg/mL、松柏苷的浓度为0.0156mg/mL、4(3H)-喹唑酮的浓度为0.0125mg/mL、槲皮素的浓度为0.0025mg/mL、色胺酮的浓度为0.01mg/mL、靛蓝的浓度为0.1875mg/mL、靛玉红的浓度为0.044mg/mL。按照上述测试条件，进样量为10μL，得到图1所示的11种对照品的色谱图。由图1可见，混合样中11中有效成分均得到有效分离。3、制本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种同时测定大青叶中11种有效成分含量的方法，所述的11种有效成分为胞苷、尿苷、腺嘌呤、鸟苷、腺苷、松柏苷、4(3H)‑喹唑酮、槲皮素、色胺酮、靛蓝和靛玉红，其特征在于：(1)制备11种有效成分的对照品溶液；(2)利用高效液相色谱法对步骤(1)中的对照品溶液进行分析，色谱条件为：采用C18色谱柱，以水和甲醇为流动相，梯度洗脱，洗脱程序为：0～6min，5％甲醇；6～20min，5％～14％甲醇；20～30min，14％～25％甲醇；30～65min，25％～50％甲醇；65～75min，50％～75％甲醇；75～85min，75％～95％甲醇；以峰面积值为纵坐标、对照品含量为横坐标，绘制各对照品的峰面积值随含量变化的标准曲线；(3)制备大青叶供试品溶液；(4)按照步骤(2)的色谱条件对大青叶供试品溶液进行分析，通过标准曲线法计算大青叶供试品溶液中胞苷、尿苷、腺嘌呤、鸟苷、腺苷、松柏苷、4(3H)‑喹唑酮、槲皮素、色胺酮、靛蓝和靛玉红的含量。

【技术特征摘要】
1.一种同时测定大青叶中11种有效成分含量的方法，所述的11种有效成分为胞苷、尿苷、腺嘌呤、鸟苷、腺苷、松柏苷、4(3H)-喹唑酮、槲皮素、色胺酮、靛蓝和靛玉红，其特征在于：(1)制备11种有效成分的对照品溶液；(2)利用高效液相色谱法对步骤(1)中的对照品溶液进行分析，色谱条件为：采用C18色谱柱，以水和甲醇为流动相，梯度洗脱，洗脱程序为：0～6min，5％甲醇；6～20min，5％～14％甲醇；20～30min，14％～25％甲醇；30～65min，25％～50％甲醇；65～75min，50％～75％甲醇；75～85min，75％～95％甲醇；以峰面积值为纵坐标、对照品含量为横坐标，绘制各对照品的峰面积值随含量变化的标准曲线；(3)制备大青叶供试品溶液；(4)按照步骤(2)的色谱条件对大青叶供试品溶液进行分析，通过标准曲线法计算大青叶供试品溶液中胞苷、尿苷、腺嘌呤、鸟苷、腺苷、松柏苷、4(3H)-...

【专利技术属性】
技术研发人员：李焘，张妮妮，赵桂红，陆苗，王晶，张天翼，王喆之，
申请(专利权)人：陕西师范大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61