一种检测血液中制造技术

本发明专利技术涉及检测技术领域，尤其涉及一种检测血液中

【技术实现步骤摘要】
一种检测血液中11种维生素D的液相色谱质谱分析方法


[0001]本专利技术涉及检测
，尤其涉及一种检测血液中
11
种维生素
D
的液相色谱质谱分析方法
。

技术介绍

[0002]维生素
D
是一种脂溶性维生素，在骨稳态和免疫调节中发挥重要作用
。
维生素
D
缺乏与心血管疾病
、
肾疾病
、
癌症和其他疾病有关
。
此外，补充维生素
D
可以降低骨折的风险，尤其是在绝经后妇女和老年男性中
。
维生素
D
有两种天然形式，包括维生素
D3(
胆钙化醇
)
和维生素
D2(
麦角钙化醇
)。
维生素
D3
可以通过紫外线辐射合成，维生素
D2
不能在体内合成，因此只能从强化食品和膳食补充剂中获得
。
维生素
D
在肝脏中通过
25
‑
羟化酶代谢为
25
‑
(OH)D
，
25
‑
(OH)D
被认为是反映体内维生素
D
状态的最佳生物标志物
。25
‑
(OH)D
在肾脏中代谢为
1,25
‑
(OH)2D
，被称为活性维生素
D
，通过维持钙和磷酸盐水平处于稳态，促进骨骼健康
。
此外，
25
‑
(OH)D
还可以通过
25
‑
(OH)D
‑
24
‑
羟化酶
(CYP24)
代谢为
24,25
‑
(OH)2D
，其浓度为总
25
‑
(OH)D
的2％～
20
％
。
此前，
24,25
‑
(OH)2D
被认为是非活性维生素
D
，随着
24,25
‑
(OH)2D
研究的深入，有报道显示：血清
24,25
‑
(OH)2D
比
25
‑
(OH)D
更能预示维生素
D
体内水平
。
此外，
24,25
‑
(OH)2D
和
25
‑
(OH)D
之间的比率，称为维生素
D
代谢产物比率，维生素
D
代谢产物比率已被建议作为维生素
D
状态的候选生物标志物和骨骼健康的功能性生物标志物
。
[0003]众所周知，所有主要的维生素
D
代谢产物都可以在
C3
位差向异构化，并且
C3
差向异构体的量在孕妇和新生儿中更高，
C3
差向异构体和维生素
D
代谢产物具有相同的母离子和子离子，如果不进行有效分离可能导致结果出现假阳性结果
。
一项婴儿和成人研究表明，在
25
‑
(OH)D
总浓度中，3‑
epi
‑
25
‑
(OH)D3导致9％
(
小于1年
)
和3％
(1
至
94
岁
)
患者可能被错误诊断为为维生素
D
充足
。
之前的一项研究表明，如果分析方法没有将差向异构体做到有效分离，这些干扰可能占总维生素
D
水平的
14
％～
55
％，因此需要对差向异构体进行有效分离，才能对体内维生素水平进行精准监测
。
[0004]目前测定血清中维生素
D
含量通常采用的方法为高效液相色谱质谱联用法
。
但已被报道的文献大多只检测
25
‑
(OH)D
，没有针对维生素
D
整个代谢通路的关键代谢物及差向异构体整体进行检测，并且检测方法大多存在着前处理操作较复杂，样本量需求较大，分析时间较长等问题，尚不适于大通量的样本检测
。
[0005]鉴于此，特提出本专利技术
。

技术实现思路

[0006]为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种检测血液中
11
种维生素
D
的液相色谱质谱分析方法
。
具体的，
11
种维生素
D
及代谢物包括：
D2、D3、1,25
‑
(OH)2D2、1,25
‑
(OH)2D3、25
‑
(OH)D2、25
‑
(OH)D3、3
‑
epi
‑
25
‑
(OH)D2、3
‑
epi
‑
25(OH)D3、24,25
‑
(OH)2D2、24,25
‑
(OH)2D3、3
‑
epi
‑
24,25
‑
(OH)2D3。
[0007]本专利技术提供了一种液相色谱串联质谱法同时检测
11
种维生素
D
的方法，其特征在
于，
11
种维生素
D
包括：
D2、D3、1,25
‑
(OH)2D2、1,25
‑
(OH)2D3、25
‑
(OH)D2、25
‑
(OH)D3、3
‑
epi
‑
25
‑
(OH)D2、3
‑
epi
‑
25
‑
(OH)D3、24,25
‑
(OH)2D2、24,25
‑
(OH)2D3、3
‑
epi
‑
24,25
‑
(OH)2D3
，至少包括以下步骤：
[0008]S1、
制备得到标准曲线方程，包括：配制内标工作液和标准工作液，制备得到标曲用上样溶液，使用高效液相色谱
‑
串联质谱仪对标曲用上样溶液进行检测，获得用于计算血液中
11
种维生素
D
含量的标准曲线方程；
[0009]S2、
待测样本的前处理，包括：本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种液相色谱串联质谱法同时检测
11
种维生素
D
的方法，其特征在于，所述
11
种维生素
D
包括：
D2、D3、1,25
‑
(OH)2D2、1,25
‑
(OH)2D3、25
‑
(OH)D2、25
‑
(OH)D3、3
‑
epi
‑
25
‑
(OH)D2、3
‑
epi
‑
25
‑
(OH)D3、24,25
‑
(OH)2D2、24,25
‑
(OH)2D3、3
‑
epi
‑
24,25
‑
(OH)2D3
，所述方法至少包括以下步骤：
S1、
制备得到标准曲线方程，包括：配制内标工作液和标准工作液，制备得到标曲用上样溶液，使用高效液相色谱
‑
串联质谱仪对所述标曲用上样溶液进行检测，获得用于计算血液中
11
种维生素
D
含量的标准曲线方程；
S2、
待测样本的前处理，包括：将内标工作液
、
待测样本和蛋白沉淀剂混匀，采用萃取剂萃取两次，获得总上清液，取所述总上清液的部分加入衍生化试剂混匀，进行衍生化处理，吹干后加入所述总上清液的剩余部分，再次吹干，加入复溶液，混匀
、
离心后取上清作为进样样本；所述萃取剂为正己烷和甲基叔丁基醚的混合溶液；
S3、
检测所述进样样本，包括：使用高效液相色谱
‑
串联质谱仪对所述进样样本进行检测，将所述进样样本的检测结果代入所述标准曲线方程，得到所述待测样本中
11
种维生素
D
的含量
。2.
根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
S1
包括：
S11、
分别配制内标工作液
I、
内标工作液
II、
标准工作液
I
和标准工作液
II
；所述内标工作液
I
中含有
D2、D3、1,25
‑
(OH)2D2
和
1,25
‑
(OH)2D3
的同位素内标；所述内标工作液
II
中含有
25
‑
(OH)D2、25
‑
(OH)D3、3
‑
epi
‑
25
‑
(OH)D2、3
‑
epi
‑
25
‑
(OH)D3、24,25
‑
(OH)2D2、24,25
‑
(OH)2D3
的同位素内标；所述标准工作液
I
中含有
D2、D3、1,25
‑
(OH)2D2
和
1,25(OH)2D3
的标准溶液；所述标准工作液
II
中含有
25
‑
(OH)D2、25
‑
(OH)D3、3
‑
epi
‑
25
‑
(OH)D2、3
‑
epi
‑
25
‑
(OH)D3、24,25
‑
(OH)2D2、24,25
‑
(OH)2D3
和3‑
epi
‑
24,25
‑
(OH)2D3
的标准溶液；
S12、
将所述标准工作液
I
和所述内标工作液
I
混合后制成梯度浓度的标曲工作液，吹干后加入衍生化试剂进行衍生化处理，衍生好的标曲工作液吹干，按照浓度梯度分别加入对应浓度的所述标准工作液
II
和所述内标工作液
II
，并加入复溶液，混合得到所述标曲用上样溶液；
S13、
使用高效液相色谱
‑
串联质谱仪对所述标曲用上样溶液进行检测，获得标准曲线方程
。3.
根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述标准工作液
I
的配制方法为：取
D2、D3
固体标准品用无水乙醇或甲醇溶解得到母液，与已知浓度的
1,25
‑
(OH)2D2
和
1,25
‑
(OH)2D3
液体标准品混合，用无水乙醇或甲醇继续稀释，得到所述标准工作液
I
；所述标准工作液
II
的配制方法为：取
24,25
‑
(OH)2D2
固体标准品用体积百分比为
70
％～
100
％甲醇水溶液或体积百分比为
70
％～
100
％乙醇水溶液溶解得到母液，与已知浓度的
25
‑
(OH)D2、25
‑
(OH)D3、3
‑
epi
‑
25
‑
(OH)D2、3
‑
epi
‑
25
‑
(OH)D3、24,25
‑
(OH)2D3
和3‑
epi
‑
24,25
‑
(OH)2D3
液体标准品混合，然后采用体积百分比为
70
％～
100
％甲醇水溶液或体积百分比为
70
％～
100
％乙醇水溶液继续稀释，得到所述标准工作液
II
；
所述内标工作液
I
的配制方法为：
D2、D3、1,25
‑
(OH)2D2
和
1,25
‑
(OH)2D3
同位素内标的市售液体标准品采用无水乙醇或甲醇进行稀释，得到所述内标工作液
I
；所述内标工作液
II
的配制方法为：
25
‑
(OH)D3、24,25
‑
(OH)2D3、24,25
‑
(OH)2D2
同位素内标的固体标准品采用体积百分比为
70
％～
100
％甲醇水溶液或体积百分比为
70
％～
100
％乙醇溶解得到母液，与已知浓度的
25
‑
(OH)D2、3
‑
epi
‑
25
‑
(OH)D2、3
‑
epi
‑
25
‑
(OH)D3
和3‑
epi
‑
24,25
‑
(OH)2D3
同位素内标液体标准品混合，采用体积百分比为
70
％～
100
％甲醇水溶液或体积百分比为
70
％～
100
％乙醇进行稀释，得到所述内标工作液
II。4.
根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述衍生化试剂选自
50
～
500
μ
g/mL
的
PTAD
溶液，所述衍生化的时间为
20
～
60min
；所述复溶液选自含有体积百分比为
0.05
％～
0.2
％甲酸
、
体积百分比为
60
％～
100
％甲醇的水溶液；所述蛋白沉淀剂选自甲醇或无水乙醇；所述萃取剂为正己烷和甲基叔丁基醚体积比为2：1～4：1的混合溶剂
。5.
根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，
S12
中：所述标准工作液
I
和所述内标工作液
I
的体积比为1：1～2：1；所述内标工作液
I
和所述衍生化试剂的体积比为1：
10
～1：
20
；所述标准工作液
I
和所述标准工作液
II
的体积比为1：1；所述标准工作液
II、
所述内标工作液
II
和所述复溶液的体积比为2：1：
7。6.
根据权利要求5所述的方法，其特征在于，
S12
中，加入衍生化试剂，在转速为
1500
～
2500rpm
下涡旋混匀
30s
～
1min
后进行衍生化处理，加入复溶液后，在转速为
1500
～
2500rpm
下涡旋混匀1～
3min
，得到标曲用上样溶液
。7.
根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，
S2
中，将所述内标工作液
I、
所述内标工作液
II、
所述待测样本和蛋白沉淀剂混合，所述内标工作液
I
和所述内标工作液
II
的体积比为1：1；所述待测样本和蛋白沉淀剂的体积比为1：1～2：1；所述用于衍生化的上清液和所述剩余部分的上清液的体积比...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾永娟，刘春冉，刘杏立，张杰，倪君君，
申请(专利权)人：北京和合医学诊断技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：