一种采用高效液相色谱法同时检测乳中克拉维酸和他唑巴坦的方法技术

本发明专利技术公开了一种采用高效液相色谱法同时检测乳中克拉维酸和他唑巴坦的方法，属于食品检测技术领域。该方法是将样品进行前处理后按照如下色谱条件利用高效液相色谱进行测定；所述色谱条件为：色谱柱为C18色谱柱；检测波长为210nm‑220nm；流动相为磷酸溶液‑甲醇；流速为0.7mL/min‑1.2mL/min；进样量为10μL；洗脱时间为10min。结果表明克拉维酸和他唑巴坦的含量在12.5～200μg/mL的浓度范围内具有良好的线性关系，且相关系数是0.9990和0.9992，采用空白基质匹配标准溶液的方法进行标准校正，显示克拉维酸和他唑巴坦的平均回收率在81％～92％之间，相对标准偏差小于1.650％。该方法适用于乳中β‑内酰胺酶抑制剂克拉维酸和他唑巴坦的同时检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种采用高效液相色谱法同时检测乳中克拉维酸和他唑巴坦的方法，属于食品检测

技术介绍
克拉维酸和他唑巴坦都是竞争性β-内酰胺酶抑制剂，可以与β-内酰胺酶结合后使其失活，具有抑制革兰氏阳性菌和阴性菌的作用。抗生素的大量应用，导致其在乳中的残留问题受到广泛关注。为了躲避抗生素的检出，有些人在乳中添加β-内酰胺酶，用以降解抗生素，从而无法判断乳中是否含有抗生素。所以，针对这一现象，建立了关于乳中β-内酰胺酶的检测方法。但是，有些人又利用β-内酰胺酶抑制剂能不可逆地与β-内酰胺酶结合的性质，在乳中添加β-内酰胺酶抑制剂，使β-内酰胺酶失去活性，导致阳性奶不能被检测出来。关于乳中β-内酰胺酶抑制剂的检测方法在国内外还没有现行的检测标准发布，国外由于其文化发展程度的差异，主要将目标放在临床医疗中的使用情况，并没有看到克拉维酸和他唑巴坦在乳中的报道；而国内对于克拉维酸和他唑巴坦的检测方法的报道很少，文献报道的方法又主要集中在微生物法、酶法、毛细管电泳法等。由于目前尚无良好有效的检测手段，建立乳中β-内酰胺酶抑制剂克拉维酸和他唑巴坦的检测方法非常重要。
技术实现思路
为解决现有技术的不足，本专利技术提供了一种采用高效液相色谱法同时检测乳中克拉维酸和他唑巴坦的方法，采用的技术方案如下：本专利技术的目的在于提供一种采用高效液相色谱法同时检测乳中β-内酰胺酶抑制剂克拉维酸和他唑巴坦的方法，该方法步骤如下：1)将样品进行前处理；2)按照如下色谱条件利用高效液相色谱进行测定；所述色谱条件为：色谱柱为C18色谱柱；检测波长为210nm-220nm；流动相为磷酸溶液-甲醇；流速为0.7mL/min-1.2mL/min；进样量为10μL；洗脱时间为10min。优选地，所述前处理，是称取1份牛奶与乙腈混合，震荡混匀后离心，取上清液与正己烷混合，震荡混匀后离心，弃去正己烷层，氮气吹干后，用流动相复溶，最后过微孔滤膜。优选地，所述磷酸溶液浓度为0.01％-0.03％；pH为3.5-4.5。更优选地，所述磷酸溶液浓度为0.02％；pH为4。优选地，所述磷酸溶液-甲醇，体积比为95:5-90:10。更优选地，所述磷酸溶液-甲醇，体积比为90:10。优选地，所述C18色谱柱，规格为4.6mm×250mm，5μm。优选地，具体步骤如下：1)将样品进行前处理：称取1份牛奶与3份-5份乙腈混合于离心管中，震荡混匀后离心，取上清液与4份-6份正己烷混合于另一离心管中，震荡混匀后离心，弃去正己烷层，在35℃-45℃氮气吹干后，用流动相复溶，最后过微孔滤膜；2)按照如下色谱条件利用高效液相色谱进行测定；所述色谱条件为：色谱柱为4.6mm×250mm，5μm的C18色谱柱；检测波长为210-220nm；流动相为体积比为95:5-90:10的磷酸溶液-甲醇；流速为0.7mL/min-1.2mL/min；进样量为10μL；洗脱时间为10min；所述磷酸溶液浓度为0.01％-0.03％，pH为3.5-4.5。更优选地，具体步骤如下：1)将样品进行前处理：称取1份牛奶与4份乙腈混合于离心管中，震荡混匀后离心，取上清液与5份正己烷混合于另一离心管中，震荡混匀后离心，弃去正己烷层，在40℃氮气吹干后，用流动相复溶，最后过微孔滤膜；2)按照如下色谱条件利用高效液相色谱进行测定；所述色谱条件为：色谱柱为4.6mm×250mm，5μm的C18色谱柱；检测波长为215nm；流动相为体积比为90:10的磷酸溶液-甲醇；流速：1.0mL/min；进样量为10μL；洗脱时间为10min；所述磷酸溶液浓度为0.02％，pH为4。以上所述任一方法在同时检测克拉维酸和他唑巴坦中的应用。本专利技术对采用HPLC法同时检测乳中β-内酰胺酶抑制剂克拉维酸和他唑巴坦的色谱条件进行了优化，取得最佳色谱条件，然后针对此条件进行克拉维酸和他唑巴坦方法学验证。本专利技术有益效果：本专利技术采用高效液相色谱法建立了乳中β-内酰胺酶抑制剂克拉维酸的同时检测方法，样品采用乙腈除蛋白，正己烷脱脂的方法，最佳色谱条件为：色谱柱为HypersilODS-2C18(4.6mm×250mm，5μm)，流动相为0.02％磷酸溶液(pH4)-甲醇(90:10)，检测波长为215nm，流速为1mL/min。该方法的线性范围为12.5～200μg/mL，相关系数为0.9990和0.9992，平均回收率在81％～92％之间，相对标准偏差小于1.650％。本专利技术方法操作简便，结果可靠，对于保证产品的质量，保护消费者健康具有十分重要的作用，具有一定的现实和指导意义。适用于乳中β-内酰胺酶抑制剂克拉维酸和他唑巴坦的同时检测。附图说明图1最佳色谱条件下克拉维酸和他唑巴坦标准溶液的色谱图。图2最佳色谱条件下原料乳中添加克拉维酸和他唑巴坦的色谱图。图3克拉维酸和他唑巴坦的标准曲线。具体实施方式下面结合附图对本专利技术的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本专利技术技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本专利技术技术方案的精神和范围，均应涵盖在本专利技术的保护范围中。实施例1：一、标准储备液的制备精确称取克拉维酸和他唑巴坦标准品，将其配成浓度为1mg/mL的标准储备液，使用时用流动相稀释成所需的浓度，所有溶液使用前需过0.45μm的微孔滤膜。二、液相色谱条件色谱柱：HypersilODS-2C18(4.6mm×250mm，5μm)；检测波长：210-220nm(优选为215nm)；流动相：0.02％磷酸溶液(pH4)-甲醇(90:10)；流速：0.7mL/min-1.2mL/min(优选为1mL/min)；进样量：10μl；梯度洗脱时间：10min。三、样品前处理方法称取1份牛奶与3份-5份乙腈混合于离心管中，震荡混匀后离心，取上清液与4份-6份正己烷混合于另一离心管中，震荡混匀后离心，弃去正己烷层，在35℃-45℃氮气吹干后，用流动相复溶，最后过微孔滤膜。经试验发现牛奶与乙腈的最佳体积比为1:4，牛奶与正己烷的最佳体积比为1:5时，氮气吹干最佳温度为40℃，即称取1份(如1mL)牛奶与4份(如4mL)乙腈混合于离心管中，震荡混匀(如1min)后离心(如4000r/min，15min)，取上清液与5份(如5mL)正己烷混合于另一离心管中，震荡混匀(如1min)后离心(如4000r/min，8min)，弃去正己烷层，重复除脂2次，在40℃氮气吹干后，用流动相复溶，最后过微孔滤膜(如0.45μm)。四、色谱条件的优化1、流动相选择及配比的优化本试验首先考察了同等条件下甲醇-水(10：90)和乙腈-水(10：90)两种流动相对物质分离效果的影响。结果表明，当流动相为乙腈-水时，色谱峰拖尾；当流动相为甲醇-水时，峰型好，分离度高，待测物质可得到好的洗脱效果。因此，本试验确定甲醇-水为流动相。确定甲醇-水为流动相后，考察甲醇与水以不同的比例存在时，对待测物质分离效果的影响。结果表明，甲醇比例从5％到35％的变化过程中，随着甲醇浓度的降低，保留时间逐渐延长(表-1)。但当甲醇浓度低于10％时，分离条件没有达到最佳状态，杂质和克拉维酸与他唑巴坦没有完全分开。因此甲醇-水最佳体积比＝10:90。表1流动相配比与保留时间的关系2、缓本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种采用高效液相色谱法同时检测乳中克拉维酸和他唑巴坦的方法，其特征在于步骤如下：步骤一：将样品进行前处理；步骤二：按照如下色谱条件利用高效液相色谱进行测定；所述色谱条件为：色谱柱为C18色谱柱；检测波长为210nm‑220nm；流动相为磷酸溶液‑甲醇；流速为0.7mL/min‑1.2mL/min；进样量为10μL；洗脱时间为10min。

【技术特征摘要】
1.一种采用高效液相色谱法同时检测乳中克拉维酸和他唑巴坦的方法，其特征在于步骤如下：步骤一：将样品进行前处理；步骤二：按照如下色谱条件利用高效液相色谱进行测定；所述色谱条件为：色谱柱为C18色谱柱；检测波长为210nm-220nm；流动相为磷酸溶液-甲醇；流速为0.7mL/min-1.2mL/min；进样量为10μL；洗脱时间为10min。2.根据权利要求1所述方法，其特征在于步骤一所述前处理是称取1份牛奶与乙腈混合，震荡混匀后离心，取上清液与正己烷混合，震荡混匀后离心，弃去正己烷层，氮气吹干后，用流动相复溶，最后过微孔滤膜。3.根据权利要求1所述方法，其特征在于步骤二所述C18色谱柱，规格为4.6mm×250mm，5μm。4.根据权利要求1所述方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：于国萍，郭佩佩，刘鹏，陈媛，范美婧，姚宇秀，孙琪，藏小丹，吴昊，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23