25羟维生素D检测试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术涉及25羟维生素D检测试剂盒及其制备方法。该试剂包括第一试剂、第二试剂，可选地还可以包括校准品。第一试剂包含25羟维生素D抗体、维生素D结合蛋白抗体和缓冲液；第二试剂含有结合有25羟维生素D抗原的微球和缓冲液。该试剂盒利用样本中的25羟维生素D与结合在微球表面的抗原竞争结合25羟维生素D抗体，使得结合有25羟维生素D的微球与25羟维生素D抗体反应形成的浊度下降，通过该浊度的下降程度推算样本中25羟维生素D的含量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及临床体外诊断及医学免疫学领域；具体地涉及一种免疫检测试剂；更进一步地，本专利技术涉及一种25羟维生素D检测试剂盒及其制备方法。
技术介绍
维生素D也称抗佝偻病维生素，又可分为维生素D2和维生素D3。维生素D2多含于植物性食物中，它是由植物的麦角固醇经阳光照射而合成的，维生素D3可由人体皮肤和脂肪组织在7-脱氢胆固醇经过阳光照射合成。维生素D2属脂溶性维生素，来自食物中的维生素D与脂肪一起经小肠吸收，在胆汁协助下形成乳糜微粒，由淋巴管进入血液，与自身合成的维生素D3 —起转运入肝脏。在肝脏中经肝细胞微粒体中的单氧酶系统(25-羟化酶)的作用，形成25羟维生素D。25羟维生素D在肾近端小管上皮细胞线粒体内α羟化酶系统的作用下转变为1，25 (OH)2D3，它是维生素D最大的生物作用形式，可以促进肠道钙结合蛋白的合成。而25羟维生素D是代谢中的主要循环形式，能够反映机体的维生素D水平。维生素D缺乏又称维生素D缺乏性佝偻病。常见于婴幼儿，多见于膳食中缺乏维生素D，或者是人体缺乏阳光的照射。由于体内维生素D不足而引起钙、磷代谢障碍，钙盐不能正常地沉积于骨骼的生长部分，以致出现生长骨发生病变为特征的一种慢性营养性疾病，称为佝偻病。如果该病发生于成人，则出现发育成熟骨骼的钙化不全，称为骨软化症。研究还表明，维生素D缺乏可能使某些癌症、心血管疾病、自身免疫性疾病和感染性疾病的发病风险升闻。根据当前糖尿病报告杂志上发表的结果，3，262例年龄50-70岁之间的中国人参加的一项研究表明94%的人维生素D缺乏或不足，这些人中有42%还有代谢综合征。其它一些研究表明，维生素D缺乏和不足在中国的孕妇以及6-16岁的儿童中也很常见。而长期摄入过多的维生素D(5000IU)，将引起高血钙和高尿钙。特征为食欲减退，过度口渴、恶心、呕吐、烦躁、体弱、便泌腹泻交替出现，严重者将因肾钙化、心脏和大动脉钙化而死亡。随着医疗专业人员和患者意识到维生素D缺乏的潜在健康风险，实验室检验量激增，需要我们提供更快、更准、更有效的检测方法，帮助医生和患者更早的得到检测结果。目前25羟维生素D的测定方法主要有酶联免疫法(如CN102628872A中公开的方法和试剂盒，以及DRG提供的25-0H维他命D (总)检测试剂盒EIA5396)、放射免疫法(如Hollis BW等人，1985)、液相色谱-质谱检测法(如郑晓艳等人，2012)以及化学发光法(如单咏梅等人，2011 ;索灵生产的25-羟基总维生素D定量测定试剂盒(化学发光法))。酶联免疫法自动化程度不高，且受人为因素影响较大。放射免疫法存在着环境污染问题；液相色谱质谱操作复杂，用时较长；而化学发光法灵敏度虽高，但检测成本较高，需要特定化学发光仪，这些原因导致其应用范围较小。本专利技术采用胶乳增强免疫透射比浊法测定人样本中25羟维生素D浓度，该方法对仪器设备要求不高，没有环保和操作人员自身防护等问题。而目前市场上还未出现胶乳增强免疫透射比浊法测定人样本中25羟维生素D浓度的试剂盒，与其它测定方法比较，本方法简便快速、灵敏可靠，普通自动或半自动生化分析仪就可，有较大应用范围和实用价值。
技术实现思路
根据本专利技术的第一方面，提供了一种25羟维生素D检测试剂盒，其包含第一试剂，和第二试剂。第一试剂包含25羟维生素D抗体、维生素D结合蛋白抗体和缓冲液，第二试剂包含结合有25羟维生素D抗原的微球和缓冲液。在一些实施方式中，第一试剂和第二试剂中的缓冲液选自磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、MES缓冲液、硼酸缓冲液、醋酸盐缓冲液、2-吗啉乙磺酸缓冲液或氯化铵缓冲液中的一种或几种；缓冲液浓度为10-500mM。在一些实施方式中，第一试剂和第二试剂中的缓冲液类型可以相同也可以不同；第一试剂和第二试剂中的缓冲液浓度可以相同也可以不同。在一些优选实施方式中，第一试剂和第二试剂中的缓冲液类型相同；第一试剂和第二试剂中的缓冲液浓度不同。在一个具体实施方式中，第一试剂的缓冲液是50mM MES缓冲液；第二试剂的缓冲液是20mM MES缓冲液。本领域技术人员可以理解，随着缓冲液类型、浓度等因素的改变，缓冲液的PH值可以有所不同。在一些实施方式中，25羟维生素D抗体为多克隆抗体或单克隆抗体；维生素D结合蛋白抗体为多克隆抗体或单克隆抗体；其中多克隆抗体源自兔、羊或鸡，单克隆抗体源自鼠或兔。在一些实施方式中，所述25羟维生素D抗原为自然抗原或人工合成抗原。在一些实施方式中，所述微球是由聚苯乙烯、丙烯酸、丙烯酸相关酯类中的一种或几种聚合而成的胶乳颗粒；微球直径在150-500nm之间。在一个具体实施方式中，所述微球是聚苯乙烯胶乳颗粒，微球直径为223nm。根据需要，根据本专利技术的25羟维生素D检测试剂盒还包括校准品，校准品主要用于校准测量系统、评价测量程序或为待测样本赋值。因此，所述校准品包含已知浓度的25羟维生素D，校准品的值甚至可以追溯至参考物质或者追溯至参考方法(IS017511:2003)。本领域技术人员可以根据待测物质的浓度范围，采用本领域常用的方法自行制备适当浓度的校准品，也可以使用市售校准品、或制造商提供的工作校准品等。在一些具体实施方式中，根据本专利技术的25羟维生素D检测试剂盒还包括若干不同浓度的校准品，例如2个、3个、4个、5个甚至更多浓度的校准品。在一个实施方式中，本专利技术的25羟维生素D检测试剂盒包括5个不同浓度的校准品。校准品含有25轻维生素D(分别为，但不限于，20ng/ml、45ng/ml、65ng/ml、100ng/ml和150ng/ml)、缓冲液，适当时还含有稳定剂、或防腐剂等。校准品可制备成液体形式、干粉或冻干粉形式。根据本专利技术的另一方面，提供了一种结合有25羟维生素D抗原的微球的制备方法，包括步骤:活化25羟维生素D抗原；活化微球；将活化的25羟维生素D抗原与活化的微球连接，从而获得结合有25羟维生素D抗原的微球。其中活化25羟维生素D抗原的步骤与活化微球的步骤的操作顺序是可互换的。在一些实施方式中，活化25羟维生素D抗原的步骤所用的试剂选自羰基二咪唑、无水丙酮、二氨基二丙基亚胺、乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺和2-吗啉乙磺酸中的一种或多种。在一些实施方式中，所述微球为羧基修饰的微球。采用本专利技术的试剂盒，第一试剂包含足够多的维生素D结合蛋白抗体，其能够将维生素D与维生素结合蛋白分开；还包含足够多的25羟维生素D抗体，受试者样本(如全血、血浆、血清)中的25羟维生素D可以和该抗体发生特异性结合；第二试剂含有结合有25羟维生素D抗原的微球，微球上的25羟维生素D抗原和未结合样本中25羟维生素D的剩余抗体可以发生特异性反应；利用胶乳增强免疫比浊的方法原理，检测微球与剩余抗体反应产生的吸光度，可以推算出样本中25羟维生素D的含量。附图说明图1:25羟维生素D试剂盒标准曲线。图2:本专利技术方法和对照方法所制备的试剂之间标准曲线的比较。 本专利技术方法；■对照方法。图3:本专利技术的试剂盒与酶联免疫分析法的血清测值的相关性。具体实施例方式为了使本专利技术易于理解，下面结合具体实施例进一步阐述本专利技术。除非另有指明，“％”表示质量/体积。以下提供了本专利技术实施方式中所使用的具体材料及其来源。但是，应当理解的是，这些仅仅是示例性的，并不意图限本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种25羟维生素D检测试剂盒，其包含：第一试剂，和第二试剂；其中，第一试剂包含25羟维生素D抗体、维生素D结合蛋白抗体和缓冲液，第二试剂包含结合有25羟维生素D抗原的微球和缓冲液。

【技术特征摘要】
1.一种25羟维生素D检测试剂盒，其包含: 第一试剂，和 第二试剂； 其中， 第一试剂包含25羟维生素D抗体、维生素D结合蛋白抗体和缓冲液， 第二试剂包含结合有25羟维生素D抗原的微球和缓冲液。2.根据权利要求1所述的25羟维生素D检测试剂盒，其中 所述缓冲液选自磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、MES缓冲液、硼酸缓冲液、醋酸盐缓冲液、2-吗啉乙磺酸缓冲液或氯化铵缓冲液中的一种或几种； 所述缓冲液浓度为10-500mM。3.根据权利要求1所述的25羟维生素D检测试剂盒，其中 所述维生素D结合蛋白抗体为多克隆抗体或单克隆抗体； 所述25羟维生素D抗体为多克隆抗体或单克隆抗体； 其中多克隆抗体源自兔、羊或鸡，单克隆抗体源自鼠或兔。4.根据权利要求1所述的25羟维生素D检测试剂盒，其中 所述25羟维生素D抗原为自然抗原或人工合成抗原。5.根据权利要求1所述的25羟维生素D检...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘鹤，张小锐，蔡华雅，刘希，
申请(专利权)人：北京九强生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：