偶联物的制备方法技术

本申请涉及偶联物的制备方法。具体而言，本申请的6

【技术实现步骤摘要】
偶联物的制备方法
[0001]本申请是2020年1月2日提交的2020100003217《6
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磷酸葡萄糖脱氢酶突变体及其在制备万古霉素检测试剂中的用途》的分案申请。


[0002]本申请涉及生物检测领域，特别是涉及一种突变的酶6
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磷酸葡萄糖脱氢酶(简称G6PDH)及其在万古霉素检测试剂盒中的应用。

技术介绍

[0003]半抗原，某些小分子物质(分子量小于4000Da)，其单独不能诱导免疫应答，即不具备免疫原性，但当其与大分子蛋白质或非抗原性的多聚赖氨酸等载体交联或结合后可获得免疫原性，诱导免疫应答。这些小分子物质可与应答效应产物结合，具备抗原性，它只有免疫反应性，不具免疫原性，又称不完全抗原。
[0004]半抗原能与对应抗体结合出现抗原
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抗体反应，又不能单独激发人或动物体产生抗体的抗原。它只有免疫反应性，不具免疫原性，又称不完全抗原。大多数多糖、类脂、激素、小分子药物都属于半抗原。如果用化学方法把半抗原与某种蛋白分子(载体)结合，会获得新的免疫原性，并能刺激动物产生相应的抗体。半抗原一旦与蛋白结合，就构成该蛋白质的一个抗原簇。一些比一般半抗原分子量小，但有特异结构的化学活性基团物质(如青霉素、磺胺剂等)，称为简单半抗原。
[0005]小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，多采用竞争模式。原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，显色愈浅。小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。
[0006]万古霉素(Vancomycin)结构式如下图所示：
[0007][0008]万古霉素分子量为1485.71，为窄谱抗生素，仅对革兰阳性菌有效(如溶血性链球
菌、肺炎球菌及肠球菌等)，对耐药金葡菌本品尤为敏感。
[0009]万古霉素的作用机制是抑制细菌细胞壁的合成，它主要和细菌细胞壁结合，而使某些氨基酸不能进入细胞壁的糖肽中。临床主要用于耐青霉素金葡菌所引起的严重感染，如肺炎、心内膜炎及败血症等，对溶血性链球菌引起的感染及败血症等也有较好的疗效。万古霉素还可以用于治疗结肠炎和肠道炎症；万古霉素还经常用于安装心脏导管、静脉导管等装置时的预防感染。
[0010]万古霉素可以单独用药，也可以联合用药。万古霉素与其他抗生素无交叉耐药性，极少耐药菌株。主要用于心内膜炎、败血症、伪膜性肠炎等。
[0011]万古霉素口服不吸收，单剂静脉滴注400mg，滴注完毕即达到血药峰浓度25.18mg/L，8小时血浓度平均为1.90mg/L，有效血浓度可维持6至8小时。单次静脉滴注800mg，高峰血浓度平均为50.07mg/L。静脉滴注后，主要经肾脏排泄，单次静滴400mg，24小时尿中平均总排泄率为81.1％；单次静滴800mg，24小时尿中平均总排泄率为85.9％。
[0012]目前已知的万古霉素检测方法主要有：高效液相色谱法(HPLC)、发光免疫、酶联免疫吸附剂测定(ELISA)等方法。HPLC法需要复杂的样品前处理，操作复杂周期长且成本昂贵；发光免疫法试剂成本昂贵，不适合常规治疗药物检测，更不利于大范围推广。
[0013]现有的均相酶免疫测定法、胶乳凝集比浊法常常因制备工艺复杂、批间差大，应用受到一定限制。
[0014]现有技术CN108717117A描述了一种万古霉素检测试剂盒。然而，现有技术的方法依赖于对小分子药物(万古霉素)自身所带反应基团进行的激活，之后再与酶进行反应。这样的偶联方法会出现同一葡萄糖六磷酸脱氢酶上链接有多个万古霉素的情况，且偶联位点难以确保一致性，难以保证小分子药物和酶之间的定向1：1反应，而导致批间差异大。

技术实现思路

[0015]鉴于本领域的需求，本申请提供了一种新型的6
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磷酸葡萄糖脱氢酶突变体、及其在制备万古霉素检测试剂盒中的用途。
[0016]根据一些实施方案，提供了一种6
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磷酸葡萄糖脱氢酶突变体。区别于已有发表的专利US006090567A(Homogeneous immunoassays using mutant glucose
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phosphate dehydrogenases)的6磷酸葡萄糖脱氢酶的突变体，本申请的6
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磷酸葡萄糖脱氢酶突变体，其包含选自以下的突变：D306C、G426C、D375C。
[0017]根据一些实施方案，提供了一种6
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磷酸葡萄糖脱氢酶突变体，所述6
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磷酸葡萄糖脱氢酶突变体是选自以下的序列所示：SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4。
[0018]根据一些实施方案，提供了一种多核苷酸，其编码本申请的6
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磷酸葡萄糖脱氢酶突变体。
[0019]根据一些实施方案，提供了一种表达载体，其包含本申请的多核苷酸。
[0020]根据一些实施方案，提供了一种宿主细胞，其包含本申请的表达载体。宿主细胞可以是原核(如细菌)或真核(如酵母)。
[0021]根据一些实施方案，提供了一种偶联物，其是本申请的6
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磷酸葡萄糖脱氢酶突变体与半抗原按照摩尔比1：n偶联而成。
[0022]在一些实施方案中，n是1至50，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、
16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50。
[0023]在一些具体的实施方案中，本申请的6
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磷酸葡萄糖脱氢酶突变体与半抗原按照摩尔比优选为1：1。
[0024]在一些具体的实施方案中，半抗原的分子量为100Da至4000Da，例如：100、150、200、250、300、350、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、520、550、570、600、620、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000。
[0025]根据本申请，技术人员将理解，“半抗原”还包含其衍生物的形式。为了便于和6
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磷酸葡萄糖脱氢酶进行偶联，对于那些自身不带有偶联基团(例如，与巯基反应的基团)的半抗原(例如万古霉素)，可以经改造而带有接头，以便和巯基共价结合。因此，在本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种偶联物的制备方法，其包括步骤：1)提供万古霉素衍生物；2)提供6
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磷酸葡萄糖脱氢酶突变体；3)所述6
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磷酸葡萄糖脱氢酶突变体与所述万古霉素衍生物发生1:1偶联；所述万古霉素衍生物是式I所示：其中，m为1至10的整数，优选1至5的整数；相较于野生型6
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磷酸葡萄糖脱氢酶，所述6
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磷酸葡萄糖脱氢酶突变体包含D306C或D375C突变；所述6
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磷酸葡萄糖脱氢酶突变体是SEQ ID No.2或SEQ ID No.3序列所示。2.根据权利要求1所述的方法，其包括步骤：1)在非质子性溶剂中提供所述万古霉素衍生物；2)在缓冲液中提供所述6...

【专利技术属性】
技术研发人员：张启飞，金石，龚俊，王贵利，封建新，刘希，
申请(专利权)人：北京九强生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：