一种产顺式-4-羟脯氨酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种产顺式‑4‑羟脯氨酸的方法，该方法通过在宿主菌细胞内构建过表达脯氨酸羟化酶基因Ecp4H，利用CRISPR‑Cas9技术抑制脯氨酸降解途径中脯氨酸羟化酶基因

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物发酵领域，具体涉及一种产顺式-4-羟脯氨酸的方法。
技术介绍
羟脯氨酸（hydroxyproline），亚氨基酸之一，通常在第四位上带有羟基，但有时也在第3位上。由于有两个不对称的碳原子，所以有4种立体异构体。在动物胶和骨胶原中含有L-羟脯氨酸。自然界中不存在D-羟脯酸。是生物体内广泛存在的具有生物活性的含氮碱，可以通过脯氨酸羟化酶生成。在食品、医学和工业上具有广泛的应用。在食品上,羟脯氨酸可作为婴儿的营养物质来源来补充甘氨酸丙氨酸和葡萄糖，羟脯氨酸还有独特的甜味能改善饮料的风味，常作为饮料的添加剂；医学上，在食品和饮料中添加可防止过敏性炎症，衍生物N-乙酰羟脯氨酸可用于治疗结蹄组织疾病和风湿性关节炎；顺式-4-羟脯氨酸作为抗癌药物治疗各种癌症，包括肝，膀胱，前列腺，肾盂等。防止骨胶原折叠成一个稳定的三螺旋构象,从而减少瘤细胞生长和纤维化过程中胶原过度沉积；抗肝纤维化、抗高血压。随着经济快速发展，大气污染和全球变暖的趋势日益恶化。国内多采用生物提取法由明胶、骨胶、干酪素、大豆表皮等蛋白质，用盐酸水解，用亚硝化法提取亚氨酸后经树脂层析后精制、结晶而成，并且顺式-4-羟脯氨酸的生产还需要通过手性异构合成，生物法合成顺式-4-羟脯氨酸具有经济学和生态学双重意义，生物法合成顺式-4-羟脯氨酸的基因工程菌主要有大肠杆菌和酵母。目前生物法合成顺式-4-羟脯氨酸主要有两种方式：发酵法和生物转化法。发酵法原料来源广泛且可再生，成本低，产量较高，污染也较小，但其调控过程比较复杂；生物转化法产量高，成本低，过程简单，有利于下游提取操作。大肠杆菌生长速率快，生产周期短，而大肠杆菌中存在底物降解途径与羟脯氨酸产生存在竞争，而羟脯氨酸的产生需要α-酮戊二酸参加反应，而α-酮戊二酸也存在其他途径的竞争，然而敲除过多基因会抑制菌体的生长，本文通过CASI抑制putA脯氨酸脱氢酶基因，以及琥珀酸脱氢酶sucA，sucB,异柠檬酸裂解酶基因aceA,异柠檬酸激酶aceK的表达提高反应中α-酮戊二酸和脯氨酸浓度利于顺式-4-羟脯氨酸的产生。
技术实现思路
为解决现有技术问题，本专利技术的目的是提供一种产顺式-4-羟脯氨酸的方法，该方法简单易行，提高了原料利用率，节约了生产成本，该方法能利用脯氨酸产生顺式-4-羟脯氨酸即解决了生产过程中的环境污染问题，又解决了敲除多个基因会影响菌体的快速生长，又能提高底物与辅酶浓度提高产物的产生。一种产顺式-4-羟脯氨酸的方法，通过在宿主菌细胞内构建过表达脯氨酸羟化酶基因Ecp4H，利用CRISPR-Cas9技术抑制脯氨酸降解途径中脯氨酸羟化酶基因putA以及α-酮戊二酸降解途径中琥珀酸脱氢酶基因sucA、sucB，异柠檬酸裂解酶基因aceA和异柠檬酸激酶基因aceK的表达得到重组菌株，并将重组菌株发酵培养后获取全细胞，最后全细胞转化生产顺式-4-羟脯氨酸。作为上述方法优选的是，所述脯氨酸羟化酶基因putA，GenBank:AY143338.1；琥珀酸脱氢酶sucA和sucB,GeneID:7329904；异柠檬酸裂解酶基因aceA,GeneID:946829；异柠檬酸激酶aceK,GeneID:946036。作为上述方法优选的是，所述的宿主菌为大肠杆菌BL21、大肠杆菌TransB、大肠杆菌Rosetta或大肠杆菌Origami中的一种。上述方法包括以下步骤：步骤1，配种子培养基、发酵培养基、反应液、soc培养基、菌体洗液，并与培养皿、锥形瓶、离心管灭菌后备用；步骤2，构建得重组质粒pET-28a-Ecp4H，pACYC-CAS9及质粒pCDF-sucA-sucB-aceA-aceK，并转入宿主菌细胞内37℃下培养12-14h得菌种；步骤3，向离心管中依次接入种子培养基和菌种后，摇床上培养9-10h得发酵菌种；步骤4，向锥形瓶中依次接入发酵培养基和发酵菌种，摇床培养至OD至少为0.6，再加入至终浓度为0.8-1.2mmol的IPTG，诱导培养后离心8-10min，倒掉上清，收集菌体，用菌体洗液洗涤2-4遍后得备用菌体；步骤5，向灭菌后锥形瓶中依次加入反应液和备用菌体，加入缓冲溶液，并用KOH调节pH至中性，进行全细胞催化反应，反应中并用磷酸调节pH至中兴，其中，备用菌体的干重为0.41g/L；步骤6，每隔5-8h取样一次，并通过液相检测产物，待全细胞催化55-65h时结束得产物顺式-4-羟脯氨酸。作为方法优选的是，步骤1中反应液由脯氨酸、α-酮戊二酸、硫酸亚铁和维生素C组成，其中，脯氨酸密度为9-11g/L，α-酮戊二酸密度为10-12g/L，硫酸亚铁和维生素C的摩尔浓度比为3：4mmol/L。作为方法优选的是，步骤3中摇床培养温度为37℃，转速为250rpm。作为上述方法优选的是，步骤4中发酵培养基与摇瓶体积比为1：5，发酵菌种的量为发酵培养基的1-2%倍，摇床转速为200rpm，诱导培养的温度为20℃，转速为200rpm，离心用的离心力为4000g/min，离心10min。作为上述方法优选的是，步骤5中pH调节至6-8。作为pH优选的是，步骤5中pH通过磷酸调节至6.5。作为上述方法优选的是，步骤6中全细胞催化时间为60h。有益效果本专利技术方法提供了一种产顺式-4-羟脯氨酸的方法，有效降低了胞内脯氨酸在其他路径上的消耗，首次实现了用CASI系统减少了脯氨酸用于其他路径的消耗，并且抑制了降解α-酮戊二酸的竞争途径抑制了多个基因，但不影响菌体的生长，使得一种产顺式-4-羟脯氨酸的方法变得更加简单，不仅有效的减少了底物脯氨酸和α-酮戊二酸的消耗，而且大幅度提高了转化效率。这从很大程度上节约了生产成本，并对于环境的保护起到了一定的作用。（1）有效降低了胞内脯氨酸在其他路径上的消耗的培养策略，增加了CASI抑制比不增加CASI抑制产量提高了1.5倍，效果明显。（2）抑制了降解α-酮戊二酸的竞争，降低了反应成本，并且不影响菌体的生长，有利于工业化生产。附图说明图1为标准品顺式-4-羟脯氨酸的出峰时间4.1分钟；图2为标准品底物L-脯氨酸的出峰时间8.1分钟；图3为实施例2中顺式-4-羟脯氨酸的出峰时间及底物L-脯氨酸的出峰时间；图4为重组质粒pET-28a-CP4H；图5为重组质粒pACYC-Cas9；图6为重组质粒pCDF-303-putA-aceA-aceK-sucA-sucB。具体实施方式实施例1构建重组质粒1.通过金唯质基因合成公司合成优化后脯氨酸羟化酶基因构建于在体pET-28a载体上酶切位点为NdeI/XhoI.构建得重组质粒pET-28a-Ecp4H2.pACYC-CAS9蛋白为实验室提供3.pCDF-303-CriRNA-putA-sucA-sucB-aceA-aceK抑制代谢途径脯氨酸降解基因putA,琥珀酸脱氢酶基因sucA和sucB,异柠檬酸裂解酶基因aceA,异柠檬酸激酶aceK，转化pET-28a-Ecp4H，pACYC-CAS9及质粒pCDF-putA-sucA-sucB-aceA-aceK。实施例2一种产顺式-4-羟脯氨酸的方法，包括以下步骤：步骤1，配种子培养基、发酵培养基、反应液、soc培养基、菌体洗液，并与培养基、锥形瓶、离心管一起灭菌备用，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种产顺式‑4‑羟脯氨酸的方法，其特征在于，通过在宿主菌细胞内构建过表达脯氨酸羟化酶基因Ecp4H，利用CRISPR‑Cas9技术抑制脯氨酸降解途径中脯氨酸羟化酶基因putA以及α‑酮戊二酸降解途径中琥珀酸脱氢酶基因sucA、sucB，异柠檬酸裂解酶基因aceA和异柠檬酸激酶基因aceK的表达得到重组菌株，并将重组菌株发酵培养后获取全细胞，最后全细胞转化生产顺式‑4‑羟脯氨酸。

【技术特征摘要】
1.一种产顺式-4-羟脯氨酸的方法，其特征在于，通过在宿主菌细胞内构建过表达脯氨酸羟化酶基因Ecp4H，利用CRISPR-Cas9技术抑制脯氨酸降解途径中脯氨酸羟化酶基因putA以及α-酮戊二酸降解途径中琥珀酸脱氢酶基因sucA、sucB，异柠檬酸裂解酶基因aceA和异柠檬酸激酶基因aceK的表达得到重组菌株，并将重组菌株发酵培养后获取全细胞，最后全细胞转化生产顺式-4-羟脯氨酸。2.根据权利要求1所述的一种产顺式-4-羟脯氨酸的方法，其特征在于，所述脯氨酸羟化酶基因putA，GenBank:FU758039.1；琥珀酸脱氢酶sucAB,GeneID:7329904；异柠檬酸裂解酶基因aceA,GeneID:946829；异柠檬酸激酶aceK,GeneID:946036。3.根据权利要求1所述的一种产顺式-4-羟脯氨酸的方法，其特征在于，所述宿主菌为大肠杆菌BL21、大肠杆菌TransB、大肠杆菌Rosetta或大肠杆菌Origami中的一种。4.根据权利要求1所述的一种产顺式-4-羟脯氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，配种子培养基、发酵培养基、反应液、soc培养基、菌体洗液，并与培养皿、锥形瓶、离心管一起灭菌后备用；步骤2，构建得重组质粒pET-28a-Ecp4H，pACYC-CAS9及质粒pCDF-sucA-sucB-aceA-aceK，并转入宿主菌细胞内37℃下培养12-14h得菌种；步骤3，向离心管中依次接入种子培养基、抗生素和菌种后，摇床上培养9-10h得发酵菌种；步骤4，向锥形瓶中依次接入发酵培养基和发酵菌种，摇床培养至OD至...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈可泉，张博文，王昕，钱娟，蔡沛沛，欧阳平凯，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32