游离的维生素D的免疫分析制造技术

本发明专利技术公开的是从血液或血液成分，特别是血清或血浆中进行游离的25(OH)维生素D的免疫吸附，之后，测量被吸收的材料。使用氟烷基表面活性剂来增强维生素D的溶解性并且可以测量游离的维生素D。因此，本发明专利技术采用结合蛋白来吸收游离的25(OH)维生素D。其后，利用标记的维生素D化合物，优选放射性标记的、荧光标记的、发光标记的、生物素标记的、金标记的或酶标记的化合物，使包括25-OH维生素D的结合蛋白经受竞争性结合分析。可替换地，可通过质谱分析对免疫捕获的25-OH维生素D进行定量。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于分析(测定)血液或血液成分样品的游离的维生素D (freevitamin D)的免疫分析(免疫测定，immunoassay)方法。本专利技术还涉及免疫分析和用于进行(引导，conduct)这样的免疫分析的试剂盒，其中所述免疫分析包括重点照顾检验(点照顾测试，point-of-care tests)。
技术介绍
被称为“维生素D”的物质包括一组脂肪可溶解的激素原以及其代谢物和类似物。体内出现的维生素D的主要形式是维生素D2 (麦角钙化醇)和维生素D3 (胆钙化醇)。后者是维生素D的内源性形式，人类可在太阳光的影响下在皮肤中形成维生素D3。前者是从食物中摄取的维生素D的外源性形式。在美国，维生素D2被用作药物学维生素D补充物。除非另外指出，本公开内容中的术语维生素D涉及维生素D的任何一种或多种形式，包含维生素D代谢物如25-轻基-维生素D或1，25 二轻基维生素D。虽然维生素D2和D3在它们的侧链的分子结构方面不同，但是它们在现有的激素原中共有相同的生物活性，在两个步骤中，最终被代谢为也称为钙三醇(骨化三醇，calcitriol)的1，25 二羟基维生素D (1，25-(OH) 2-维生素D)，或1，25 二羟基胆钙化醇。前述的代谢物，25-羟基维生素D (25-(OH)-维生素D)或钙三醇，由肝中的转变产生，且其被认为是体内维生素D的贮藏形式。循环的维生素D主要由25- (OH)-维生素D3和25- (OH)-维生素D2组成。生物学上，25-(OH)-维生素D2与25-(OH)-维生素D3—样有效。循环中25-(OH)-维生素D2的半衰期较短。对于临床实践，推荐使用25-(OH)-维生素D分析，其测量25-(OH)-维生素D3以及25-(OH)-维生素D2 (I)。维生素D长期已被认为是重要的物质，其活化形式在骨的形成和维持中以及在人类或动物身体的其他过程中发挥作用。因此，它通过促进肠内来自食物的钙和磷的吸收和肾中钙的重吸收，用于增加钙到血流中的流量；使骨能够正常矿化和预防低血钙性抽搐。其也是造骨细胞和破骨细胞的骨成长和骨重建所必需的。维生素D缺乏引起削弱的骨矿化和导致骨软化疾病，儿童佝偻病和成人软骨病，并且可能产生骨质疏松症。维生素D在人类健康中发挥许多其他的作用，包括抑制从甲状腺的降血钙素释放。降血钙素直接地作用于破骨细胞，引起骨再吸收和软骨降解的抑制。维生素D也能抑制从甲状旁腺的甲状旁腺激素分泌，调节神经肌肉和免疫功能和减少炎症。因此，具有适当的维生素D水平对于人类和动物的健康是基本的。然而，维生素D的过量(其可能由于过量用药而发生)是有毒的。维生素D毒性的某些症状是由增加的肠钙吸收引起的血钙过多(血液中钙的水平升高)。已知维生素D毒性是高血压的原因。维生素D毒性的胃肠症状可包括厌食、恶心、和呕吐。这些症状常常伴随多尿(过多的产生尿)、烦渴(增加的口渴)、虚弱、神经过敏、瘙痒症(发痒)、和最终地肾衰竭。明显地，能够诊断可能的维生素D缺乏的受试者是重要的。特别是对于补充维生素D的受试者，能够检验潜在的维生素D过量的受试者，也是重要的。总的25-(0H)_维生素D的血清水平被认为是维生素D状态的主要指示剂(2)。然而，这种观念一直都有争议。通过维生素D结合蛋白(88%)和白蛋白(12%)结合血清中几乎所有循环的25-(OH)-维生素D。维生素D结合蛋白(DBP)是血清的主要成分，浓度为250_400mg/L血清。仅仅占据DBP的维生素D结合位点的小部分，大约为2%。25-(OH)-维生素D的非常小的部分(分数，fraction),0. 04%以游离的、非蛋白质结合形式循环。所有人类中DBP浓度都不是恒定的，并且可通过其他因素影响DBP的浓度，其他因素包括怀孕、口服避孕药的使用、肾病和肝病。DBP浓度的认识对于患者的真实的25-(0H)_维生素D状态的准确评价是至关重要的。例如，服用口服避孕药的年轻女性可能具有处于正常范围内的总的25-(0H)_维生素D水平。然而，由于她的升高的DBP，可显著地降低游离的25-(0H)_维生素D的浓度，使得她处于临床25-(0H)_维生素D不足的增加的风险之中和那个条件承担的所有风险之中。已经显示了，体内甲状腺和留醇激素的生理活性与她们的游离的、非蛋白质结合的部分的相关性，比与血浆中荷尔蒙的总的浓度的相关性更好。特别是在升高或减少了结合蛋白水平的情形中，总的循环荷尔蒙的测量可导致错误的诊断。在这样的情形中，游离循环的荷尔蒙浓度的测量提供较好的信息。这种观念被称为“游离的荷尔蒙假设”。Mendel(3)表明，游离的荷尔蒙假设很可能对于所有组织的甲状腺荷尔蒙、皮质醇、并且还对于维生素D的羟基化代谢物来说是正确的。Bikle等人(4)检验1，25-(OH) 2-维生素D的游离的荷尔蒙假设的正确性。数据表明，甚至在患有肝病和减少的DBP水平的受试者中，尽管总的1，25- (OH) 2-维生素D显著减少，好像也能很好地维持游离的1，25- (OH) 2-维生素D水平。在随后的关于25_(0H)_维生素D的研究中，推荐相同的组，从而在具有更改的结合蛋白浓度的情形中测量游离的25-(0H)_维生素D。作者推论，总的维生素D代谢物测量可能误导具有肝病的患者的维生素D状况的评价，并且推荐在进行维生素缺乏的诊断之前也确定游离的25-(OH)-维生素D水平。Bikle等人使用超滤作用以确定游离的25-(OH)-维生素D的水平(5)。这种方法需要高度纯净的放射性标记的维生素D并且倾向于过高估计游离的维生素D的部分。Lauridsen等人(6)显示，不同DBP表型的女性具有不同的1，25 (OH) 2维生素D和25 (OH)维生素D的浓度。这些作者表明，在较低的血浆25 (OH)维生素D水平下，具有Gc2_2的女性是维生素D充足的。某些
技术介绍
可涉及有关的游离的分析物的确定。美国专利4366143描述涉及有机物质或配体的游离部分的分析的专利技术，其中所述有机物质或配体以结合的和游离的形式存在于生物流体中。该方法基本上是竞争性免疫分析，其中，在一个步骤中，将标记的配体和特异性结合剂同时加入到样品中。配体的游离部分和标记的配体竞争与特异性结合剂反应，且以依赖于样品中存在的游离的配体部分的量的比例结合到特异性结合剂上。该公开方法的缺点是，由于特异性结合剂和标记的配体两者的存在，存在能够干扰结合的和游离的配体之间的平衡的多个因素，其使得该方法几乎不适用于以相对较低的量存在的游离的配体，如维生素D的情况。事实上，其并没有公开如何使用游离的维生素D测量的分析。美国专利第4，292，296号公开了用于在样品中确定游离的分析物的方法，其中所述样品含有游离的分析物和受体结合的分析物。该方法涉及两个步骤，第一步骤是将样品与分析物的吸收剂接触，以从溶液中去除分析物。第二步骤包括将吸收剂结合的分析物与标记的分析物类似物接触。因此，从吸收剂中去除溶解相，并且确定结合的和洗掉的相中的标记的量。描述了用于确定游离的甲状腺荷尔蒙的浓度的方法。美国专利申请2008/0182341涉及用于测量流体中游离的或未结合的分析物浓度的稳定剂。其表明，稳定剂防止配体与它的结合蛋白的分离。参考采用同时分析程序并且列举本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：米夏埃尔·弗朗西斯库斯·威廉默斯·科内利斯·马滕斯，乔治·亨利·帕森斯，弗朗西斯库斯·玛丽亚·安娜·罗斯马勒恩，莱昂·玛丽亚·雅各布斯·威廉默斯·斯文科尔斯，
申请(专利权)人：未来诊断有限公司，
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