25羟基维生素D检测试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种25羟基维生素D检测试剂盒及其制备方法，主要包括有：包被有高特异性鼠25羟基维生素D单克隆抗体的微孔板，所述微孔板的每个微孔内高特异性鼠25羟基维生素D单克隆抗体的包被量为0.1～0.5μg；浓度为0.1μg/ml的生物素标记的25羟基维生素D，用量为每微孔25μl。本发明专利技术25羟基纤维素D检测试剂盒灵敏度约为5nmol/L，线性范围大于同类试剂盒，精密度和准确度均在试剂盒要求范围内，并且血清样本不需要稀释即可直接加样，操作方法比同类试剂盒简单，一般技术人员即可操作，操作时间比同类试剂盒减少一半。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及检测试剂盒，特别是涉及25羟基维生素D检测试剂盒及其制备方法。
技术介绍
人体和动物每天必需从食物中摄取适量的维生素D，才能维持正常的发育和健康。成人的建议每日摄取量是5 μ g，妊娠期和哺乳期女性应当增加I倍左右的摄入量，每天手脚露30厘米，在阳光下晒30分钟，有效的防止维生素D的缺乏。但维生素D摄食过量会弓I起中毒，一些学者认为长期每日摄入25 μ g维生素D可引起中毒，这其中可能包括一些对维生素D敏感的人，但长期每天摄入125 μ g维生素D则肯定引起中毒。我国制定维生素D可耐受:最闻摄入量为20 μ go25 (OH) VD是最主要的血清VD的存在形式，其血清浓度反应了机体中可利用的VD 的状态，其结果的可靠性要优于检测血清1，25 (OH) VD水平。血清25 (OH) VD浓度随年龄而降低。老年人日照相对减少，老化皮肤产生VD数量下降，及不充分的饮食摄入，造成老年人普遍缺乏VD，增加了患骨质疏松症的风险。因此，检测25 (OH)VD血清浓度可以辅助临床对VD缺乏状态的评估，也可用于检测患者非正常血清钙水平的原因。目前25羟基维生素D检测试剂盒主要是以进口产品为主，稳定性较好的产品主要是酶联免疫法和放射性免疫法类产品。放射性免疫法检测25羟基维生素D试剂盒存在需操作经验丰富的检验员，存在放射性污染的问题，使用范围受到限制。目前通常使用的利用酶联免疫法检测25羟基维生素D的试剂盒的血清样本需要稀释才可加样,操作时间比较长，操作方法步骤比较繁琐。
技术实现思路
基于此，有必要提供一种敏感度高、特异性强、操作简便、稳定性好，无污染、重复性好的25羟基维生素D检测试剂盒。一种25羟基维生素D检测试剂盒，主要包括有(A)包被有高特异性鼠25羟基维生素D单克隆抗体的微孔板，所述微孔板的每个微孔内高特异性鼠25羟基维生素D单克隆抗体的包被量为O. I O. 5 μ g ;(B)浓度为O. I μ g/ml的生物素标记的25轻基维生素D,用量为每微孔25 μ I。在其中一个实施例中，所述25羟基维生素D检测试剂盒还包括工作浓度为O. 5 2.O μ g/ml的辣根过氧化酶标记的抗生物素蛋白；在其中一个实施例中，所述包被板的每个微孔内高特异性鼠25羟基维生素D单克隆抗体的包被量为O. 2 μ g/ml ο在其中一个实施例中，所述辣根过氧化酶标记的抗生物素蛋白的工作浓度为I.O μ g/ml ο本专利技术还提供了上述25羟基维生素D检测试剂盒的制备方法。一种25羟基维生素D检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤(I)制备包被高特异性鼠25 (OH)D单克隆抗体的微孔板按O. I O. 5μ g的包被浓度将高特异性鼠25 (OH) D单克隆抗体包被至微孔内，4°C过夜，洗涤，封闭，密封，得到包被高特异性鼠25 (OH)D单克隆抗体的微孔板；(2)按常规方法制备生物素标记的25羟基维生素D，所述生物素标记的25羟基维生素D的浓度为O. I μ g/ml O本专利技术的25羟基维生素D检测试剂盒是采用竞争法原理定量测定人血清或血浆中的25羟基维生素D和其他羟基化代谢产物。将标准品、质控品和样本加入至预包被高特异性鼠25(0H)D单克隆抗体的微孔板的微孔中，再加入生物素标记的25(0H)D抗原室温下孵育30分钟，之后冲洗。加入辣根过氧化物酶标记的抗生物素蛋白，选择地与生物素结合， 接着冲洗，再利用底物显色。终止反应后，在酶标仪下450nm处读取吸光度，25 (OH) D浓度与颜色强度成反比。上述25羟基纤维素D检测试剂盒与目前通常使用的同类检测试剂盒相比，可提高工作效率，并大幅节约成本。本专利技术采用单克隆抗体包被板条，灵敏度约为5nmol/L，线性范围大于同类试剂盒，精密度和准确度均在试剂盒要求范围内，并且血清样本不需要稀释即可直接加样，操作方法比同类试剂盒简单，一般技术人员即可操作，操作时间比同类试剂盒减少一半。且无污染，可以作为同类放射性免疫分析试剂盒的替代产品。具体实施例方式以下通过具体实施例来详细说明本专利技术。实施例I本实施例所述的25羟基维生素D检测试剂盒的主要组成成份如下I、包被有高特异性鼠25羟基维生素D单克隆抗体的微孔板所述微孔板的每个微孔内高特异性鼠25羟基维生素D单克隆抗体的包被量为O. 2 μ g ;条形微孔板(12条X8孔)，置于框架中。2、25羟基维生素D标准品O. I. 2. 3. 4. 5可直接使用，共6瓶，每瓶300ul，标准品溶液的线性浓度分别为A 0 ；B :6. 5 ；C 26 ；D 60 ；E 180 ；F :360ng/ml，分别对应标准品 0. I. 2. 3. 4. 5。3、25羟基维生素D质控品I. 2可直接使用，共2瓶，每瓶300ul，浓度分别为30ng/ml和100ng/ml。4、生物素标记的25羟基维生素D可直接使用，浓度为O. I μ g/ml，I瓶，每瓶3ml。5、酶结合物可直接使用的辣根过氧化物酶标记的抗生物素蛋白(溶于含去污剂、防腐剂和BSA缓冲溶液中)，工作浓度为I. O μ g/ml，I瓶，6. OmL。6、底物溶液可直接使用的四甲基联苯胺(TMB)底物(溶于酸性溶液中)，I瓶，12. OmL。7、终止液可直接使用的盐酸溶液(HCl、100ml/L ;工艺用水、900ml/L)。I瓶，12. OmL。8、浓缩洗液(20 X)含有去污剂和防腐剂的浓缩清洗缓冲液。I瓶，50. OmL。9、封口膜孵育时密封微孔板的粘性薄膜。所述试剂盒的制备如下(一)标准品与质控品(I)标准品的配制是由浓度为lmg/ml的25轻基VD母液及人工血清、proclin300配制而成。配制1000人份标准品，具体配制过程如下(从高浓度配起):F :取 25 羟基 VD lmg/ml 的母液 252 μ 1+699. 048ml 人工血清 +0. 7mlproclin300 ；分装；E :取配制好的标准品溶液F150ml+149. 7ml人工血清+0. 3ml proclin300 ；分装;D :取配制好的标准品溶液F50ml+249. 7ml人工血清+0. 3ml proclin300 ;分装；C :取配制好的标准品溶液F21. 65ml+278. 05m人工血清+0. 3mlproclin300 ;分装;B :取配制好的标准品溶液F5. 4ml+294. 3ml人工血清+0. 3ml proclin300 ;分装；A :加入300ml人工血清，分装。(2)质控品的配制质控品I (100ng/ml) :25 羟基 VD 标准品 F (360ng/ml) 83. 35ml+216. 35ml 人工血清+0.3ml proclin300,分装;质控品2 (30ng/ml) :25 羟基 VD 标准品 F (360ng/ml) 25ml+274. 7ml 人工血清+0.3ml proclin300,分装。( 二)包被高特异性鼠25 (OH) D单克隆抗体的微孔板外购高特异性鼠25 (OH)D单克隆抗体。按100 μ L/孔将包被液(包被液抗体2. Omg+包被缓冲液IOOOml ;包被缓冲液为=Na2CO3O. 423g/L, NaHCO3L 344g/L)加入酶标板的微孔内，4°C本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：郭志程，
申请(专利权)人：广州菲康生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：