【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种真核酵母表达系统中外源基因拷贝数的鉴定方法，并利用该鉴定方法实现酵母表达系统中重组蛋白表达产量的提高。
技术介绍
1、目前为了提高目的蛋白的表达量，通常需要构建外源基因的多拷贝宿主，但是在实践中提高拷贝数的效果往往难以与外源基因的数量呈现良好的线性关系。尽管有时多拷贝的外源基因并不会提高目的蛋白产量，但只有将二者都构建好并进行比较，才能得到优化的结果。
2、构建多拷贝宿主的方法主要有以下三种：(1)不同筛选标记法。构建不同筛选标记的表达载体，依次导入到宿主细胞中。这种方法的优点在于思路简单，操作便捷。其缺点则在于拷贝数的增加受制于可选择的筛选标记的种类(无论是营养缺陷型标记或者是抗生素标记)，而且使用多种抗生素会导致实验成本显著增加。(2)高浓度抗生素筛选压力法。外源基因通过一次单交换插入基因组形成的所有转化子中，大约有1％的几率可以形成多拷贝，而且经常是在头－尾方向(head-to-tail orientation)。这些多拷贝转化子可以通过广泛的筛选来确定，但显然这种做法是劳动密集型的。由于环境中抗生素浓度提高时，多拷贝转化子的生长速度会高于单一拷贝的转化子，因此使用抗生素(如g418和zeocin)及相应的抗性基因可以减少筛选多拷贝克隆的相关工作量。目前往往用两步法来鉴别多拷贝转化子：第一轮首先用his4等筛选标记来确定转化子中插入了外源基因，第二轮的筛选是在含有不同浓度的抗生素平板上进行，从理论上讲，低拷贝的转化子难以在高浓度抗生素平板上生长，由此筛选高拷贝的工作量可以显著降低
3、为了准确定量体外多拷贝构建法构建好的多拷贝宿主的拷贝数，目前已开发了通过qpcr荧光定量的方法，具体为：找到荧光定量与拷贝数的关系，做出标准曲线，再通过标准曲线来确定具体的拷贝数。如专利申请cn103981112a公开的方法，具体步骤为：①分别构建含目的基因和内参基因的质粒；②通过公式计算出目的基因及内参基因的拷贝数；③根据计算得到的质粒的绝对拷贝数，将目的基因及内参基因分别按10倍比稀释；④通过qpcr，将qpcr得到的ct值与稀释的拷贝数做标准曲线；⑤挑不同的转化子做qpcr，根据目的基因和内参基因的的ct值，带入标曲中，计算出目的基因拷贝数。该专利申请的技术方案是通过高浓度抗生素筛选压力法进行高拷贝的筛选，实验对象为随机转化子，不确定性较大；而且该方案需要将内参基于构建到载体上，分别做目的基因和内参基于两条标曲；另外，该方案在qpcr实验前设计引物是将完整序列从头到尾设计，故在第一次计算时，还需要将目的基因及内参基因的碱基数计算进去，较为复杂。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术旨在提供一种酵母表达系统中外源基因拷贝数的鉴定方法，该鉴定方法很好地解决了5拷贝以上的转化子不能准确确认拷贝数的问题，而且鉴定过程更为简便、高效，鉴定结果也准确可靠，进而可确定在多少拷贝范围内能得到最高的表达产量。
2、为了实现上述目的，本专利技术的技术方案具体如下：
3、一种酵母表达系统中外源基因拷贝数的鉴定方法，包括以下步骤：
4、s1、构建不同拷贝数的表达盒，将表达盒与表达载体连接得到不同拷贝数的转化子，将转化子转化至酵母细胞中获得不同拷贝数的重组子；
5、s2、提取酵母细胞和重组子的rna，反转录获得cdna；
6、s3、以cdna为模板，分别采用外源基因引物和参考基因引物进行pcr，获得不同拷贝数下外源基因和参考基因的cq值；其中，所述外源基因引物扩增的目的片段长度同参考基因引物扩增的目的片段长度相同，所述cq值为荧光信号达到阈值所经历的循环数；
7、s4、根据cq值，获得不同拷贝下的rq值；其中，所述rq值＝2^-δδcq，式中δδcq＝δcq重组子－δcq酵母细胞，δcq＝外源基因的cq值－内参基因的cq值；
8、s5、以拷贝数≤n的重组子的rq值为纵坐标，拷贝数为横坐标，制作标准曲线，其中n为3或4或5；根据标准曲线以及rq值，计算出拷贝数，进而鉴定拷贝数＞n的表达盒是否构建成功。
9、在本专利技术的鉴定方法中，步骤s1可利用多拷贝克隆技术构建不同拷贝数的表达盒，并将表达盒通过同尾酶重复地插入到表达载体，从而获得不同拷贝数的重组质粒(即转化子)，再将转化子转化至宿主细胞中，从而得到不同拷贝数的重组子。
10、优选地，在上述的鉴定方法中，转化子通过电击转化至酵母细胞中。
11、在本专利技术的鉴定方法中，步骤s2先用蜗牛酶处理酵母细胞和不同拷贝数的重组子，再用trizol法分别提取总rna，通过反转录获取酵母细胞和不同拷贝数的重组子的cdna。
12、在本专利技术的鉴定方法中，步骤s3通过pcr获得荧光信号的方法为荧光染料法，即在pcr反应液中加入荧光染料，该荧光染料在游离状态下基本不发光，与双链dna结合后才释放出荧光信号；因此在pcr反应中，随着特异性pcr产物的扩增，染料掺入双链dna而产生的信号强度与pcr产物的数量是呈正相关的。而且，在本专利技术方法中，外源基因和内参基因的扩增产物长度相同，从而将外源基因的拷贝数与外源基因和内参基因荧光强度差值建立了联系。
13、优选地，在上述鉴定方法中，pcr的反应液包括荧光染料tb green。
14、优选地，在上述鉴定方法中，外源基因的引物长度和参考基因的引物长度一致均为20-40bp，且引物的序列中gc含量为45-65％。
15、在本专利技术的鉴定方法中，内参基因为酵母细胞自身携带的基因，其中内参基因包括但不限于gapdh、act1、tif1、rpl19a、rpl35a、rps8b等。
16、在本专利技术的一具体实施例中，内参基因为gapdh，外源基因为ifnt1；外源基因的引物序列如seq id no.1～2所示，所述内参基因的引物序列如seq id no.3～4所示，两对引物扩增的片段长度一致；优选地，扩增的片段长度≤100bp。
17、在本专利技术的鉴定方法中，步骤s5利用拷贝数≤n的重组子的rq值制作标准曲线，其原因在于，拷贝数≤n的转化子能够通过现有技术(如dna凝胶电泳)准确确认拷贝数。
18、优选地，在在上述鉴定方法中，酵母细胞为毕赤酵母细胞。
19、在本专利技术的鉴定方法中，表达载体没有限制，只要能够转化至酵母细胞中并能表达外源基因即可。如在本专利技术的一具体实施例中，表达载体为ppiczaa。
20、基于本专利技术提供的鉴定方法，本专利技术进一步提供了一种提高酵母表达系本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种酵母表达系统中外源基因拷贝数的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，所述外源基因引物和参考基因引物的长度一致且为20-40bp，且引物的序列中GC含量为45-65％。
3.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，在步骤S1中，所述转化为电击转化。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S2中，先用蜗牛酶处理酵母细胞和重组子，再用Trizol法提取RNA。
5.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，在步骤S3中，所述PCR的反应液包括荧光染料TB Green。
6.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，所述酵母细胞为毕赤酵母细胞。
7.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，所述表达载体为pPICZaA。
8.根据权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于，所述内参基因为GAPDH。
9.根据权利要求8所述的鉴定方法，其特征在于，所述外源基因为IFNT1，所述外源基因的引物序列如SEQ ID NO.1～2所示，所述内参
10.一种提高酵母表达系统重组蛋白表达产量的方法，其特征在于，根据权利要求1～9任一项所述的鉴定方法，得到重组子中外源基因的拷贝数；再诱导培养各重组子，检测表达量，选择表达量最高的重组子进行生产。
...【技术特征摘要】
1.一种酵母表达系统中外源基因拷贝数的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，所述外源基因引物和参考基因引物的长度一致且为20-40bp，且引物的序列中gc含量为45-65％。
3.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，在步骤s1中，所述转化为电击转化。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤s2中，先用蜗牛酶处理酵母细胞和重组子，再用trizol法提取rna。
5.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，在步骤s3中，所述pcr的反应液包括荧光染料tb green。
6.根据权利要求1所述的鉴定方法...
【专利技术属性】
技术研发人员：廖怡辉，华权高，易汪雪，丁睿，陈思龙，符磊，
申请(专利权)人：武汉华美生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：
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