抗基质金属蛋白酶3的单克隆抗体及其制备和应用制造技术

本发明专利技术公开了抗基质金属蛋白酶3的单克隆抗体及其制备和应用，所述单克隆抗体为兔单克隆抗体A或兔单克隆抗体B，兔单克隆抗体A的重链CDR区氨基酸序列如SEQ ID NO.1～3所示且其轻链CDR区氨基酸序列如SEQ ID NO.4～6所示，兔单克隆抗体B的重链CDR区氨基酸序列如SEQ ID NO.7～9所示且其轻链CDR区氨基酸序列如SEQ ID NO.10～12所示；兔单克隆抗体A和兔单克隆抗体B可以用于开发双抗夹心法酶联免疫检测试剂盒，具有检测灵敏度高、稳定性好等优点；而且本发明专利技术通过单B细胞克隆技术生产兔单克隆抗体A和兔单克隆抗体B，成本更为低廉，生产更易放大，具有更高的推广价值。具有更高的推广价值。具有更高的推广价值。

【技术实现步骤摘要】
抗基质金属蛋白酶3的单克隆抗体及其制备和应用


[0001]本专利技术属于单克隆抗体
，具体涉及一种抗基质金属蛋白酶3的单克隆抗体及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)是一个大家族，因其需要Ca
2+
、Zn
2+
等金属离子作为辅助因子而得名。MMPs几乎能降解细胞外基质中的各种蛋白成分，破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障，在肿瘤侵袭转移中起关键性作用，被认为是肿瘤浸润转移中主要的蛋白水解酶。MMPs家族目前已分离鉴别出26个成员，编号分别为MMP
‑
1～26。
[0003]基质金属蛋白酶3(MMP
‑
3)是MMPs家族一员，其能够降解聚集的软骨连结蛋白纤维结合素、核心蛋白及Ⅳ、
Ⅶ
、
Ⅸ
型的胶原的显著活性，能导致软骨的降解。强直性脊柱炎患者的血清MMP
‑
3水平显著高于正常人群，能有效反映出患者的疾病活动及骨关节破坏程度，能为临床判断、病情进展及疗效提供科学依据。MMP
‑
3还是类风湿关节炎新的诊断指标，冠心病新的预测因子。因此，开发MMP
‑
3单克隆抗体用于诊断试剂中，对上述疾病的临床诊断具有重要意义。
[0004]单克隆抗体具有靶点性强、成药性强、副作用小等优点。目前诊断试剂盒所用单克隆抗体大多数通过杂交瘤细胞分泌产生，是将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行融合，再采用有限稀释法经过多轮筛选从而获得能产生抗原特异性抗体的杂交瘤细胞。但从脾细胞分离的B细胞并非都能有效的用于融合，有效融合比例仅为1:105～106，而融合后的杂交瘤细胞也仅有极少部分可分泌抗原特异性抗体。而且小鼠杂交瘤技术免疫原性高、半衰期短，临床效果有限；人杂交瘤技术则具有融合效率低、亚克隆易丢失等缺点。另外，还可以采用噬菌体文库技术、EBV转化B淋巴细胞技术等方法获得单克隆抗体，但是噬菌体文库展示技术在建库过程中易出现轻重链随机配对的情况，且研发周期长，EBV转化B细胞技术的抗体产量较低。而单B细胞抗体克隆表达技术可有效解决上述问题，可实现抗原特异性小鼠单克隆抗体的快速克隆和筛选鉴定分析。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术通过利用单B细胞抗体克隆技术开发出了高亲和力的临床诊断可用的抗MMP
‑
3兔单克隆抗体，而且生产放大方便，批间差可控，成本更为低廉，更好满足诊断试剂对抗体稳定性和重复性的要求。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术的技术方案具体如下：
[0007]本专利技术第一方面提供了一种抗基质金属蛋白酶3的单克隆抗体，具体为兔单克隆抗体A或兔单克隆抗体B；
[0008]其中，兔单克隆抗体A重链CDR区氨基酸序列如下所示：
[0009]CDR
‑
H1：SYDMS；
[0010]CDR
‑
H2：SIDTVGSAYYASWAKG；
[0011]CDR
‑
H3：SFYMPAFDP；
[0012]兔单克隆抗体A轻链CDR区氨基酸序列如下所示：
[0013]CDR
‑
L1：QASESVYSNNRLA；
[0014]CDR
‑
L2：LASTLAS；
[0015]CDR
‑
L3：AGYKIITDGIS；
[0016]兔单克隆抗体B重链CDR区氨基酸序列如下所示：
[0017]CDR
‑
H1：NYCCGC；
[0018]CDR
‑
H2：CIYGSSDNTYYATWAKG；
[0019]CDR
‑
H3：GFGDDYVFNL；
[0020]兔单克隆抗体B轻链CDR区氨基酸序列如下所示：
[0021]CDR
‑
L1：QASQSISSYLA；
[0022]CDR
‑
L2：RASTLAS；
[0023]CDR
‑
L3：QQHNMISNIDNF。
[0024]本专利技术第二方面提供了如上述的单克隆抗体在建立非诊断目的的MMP
‑
3的酶联免疫检测方法中的应用。
[0025]进一步地，所述酶联免疫检测方法为利用双抗夹心原理的酶联免疫检测方法。更进一步地，在该方法中，所述兔单克隆抗体A为包被抗体，所述兔单克隆抗体B为标记抗体。
[0026]本专利技术第三方面提供了如上述的单克隆抗体在制备用于检测MMP
‑
3的试剂或试剂盒中的应用。
[0027]进一步地，所述MMP
‑
3包括重组表达的MMP
‑
3，或血清中的MMP
‑
3。
[0028]本专利技术第三方面提供了如上述的单克隆抗体的制备方法，具体采用单B细胞抗体克隆技术制备，包括以下步骤：
[0029]S1、使用MMP
‑
3重组蛋白免疫兔，免疫结束后收集脾脏并分离脾细胞；
[0030]S2、筛选特异性B淋巴细胞，并提取其总RNA，合成cDNA，再利用巢式PCR获得抗体可变区及恒定区序列；
[0031]S3、将扩增的抗体基因插入载体中，转染293F细胞；
[0032]S4、收集培养上清并纯化，即得单克隆抗体。
[0033]进一步地，步骤S1所述MMP
‑
3重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示。
[0034]进一步地，步骤S2所述巢式PCR所用的引物序列如SEQ ID NO.14～28所示。
[0035]进一步地，步骤S4所述纯化具体为：将上清与PB缓冲液混合后上样protein G亲和层析柱，将含有所述抗体的洗脱液超滤浓缩后置于PBS中透析。
[0036]本专利技术的有益效果为：
[0037](1)本专利技术开发了能够用于免疫诊断试剂中的抗MMP
‑
3兔单克隆抗体对，其制备成的双抗夹心法酶联免疫检测试剂能实现临床血清中MMP
‑
3的精确检测，打破了市面上仅有鼠单抗及羊多抗用于试剂盒的现状。
[0038](2)本专利技术利用单B细胞技术的重组抗体，不仅生产放大方便，批间差可控，而且成本更低廉；经验证，相对于外购试剂盒或外购抗体对，本专利技术提供的抗体对能更好的满足诊断试剂对抗体亲和力，特异性，均一性等方面的要求，具有很高的操作性和推广价值。
附图说明
[0039]图1为实施例1中通过单B细胞技术制备抗MMP
‑
3兔单克隆抗体的实验流程图；
[0040]图2为实施例2中抗体对检测临床血清样本的结果图。
具体实施方式
[0041]为了使本专利技术所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗基质金属蛋白酶3的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体为兔单克隆抗体A或兔单克隆抗体B；所述兔单克隆抗体A的重链CDR
‑
H1、CDR
‑
H2和CDR
‑
H3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示，且其轻链CDR
‑
L1、CDR
‑
L2和CDR
‑
L3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；所述兔单克隆抗体B的重链CDR
‑
H1、CDR
‑
H2和CDR
‑
H3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示，且其轻链CDR
‑
L1、CDR
‑
L2和CDR
‑
L3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示。2.如权利要求1所述的单克隆抗体在建立非诊断目的的MMP
‑
3的酶联免疫检测方法中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述酶联免疫检测方法为利用双抗夹心...

【专利技术属性】
技术研发人员：周芳芳，郑雪松，罗绍祥，牛梦溪，徐珍，
申请(专利权)人：武汉华美生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：