一种利用病毒样颗粒制备膜蛋白的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用病毒样颗粒制备膜蛋白的方法，具体为：分别构建

【技术实现步骤摘要】
一种利用病毒样颗粒制备膜蛋白的方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种利用病毒样颗粒制备膜蛋白的方法
。

技术介绍

[0002]在生物细胞中，膜蛋白是维持细胞生理过程的最重要的组成部分，在物质运输
、
信号转导和细胞间识别等多种细胞功能中发挥着重要作用
。
人类基因组中编码的膜蛋白约占总蛋白质组的
30
％
。
这些膜蛋白与囊性纤维化
、
动脉粥样硬化
、
帕金森病和阿尔茨海默病等多种疾病相关
。
其中跨膜蛋白是目前最主要的药物靶点，占现阶段己知药物靶点的
60
％以上，以跨膜蛋白为靶点的创新药研发一直是医药领域的研究热点
。
但针对膜蛋白的靶点筛选及药物开发仍然面临巨大的挑战，其首要的困难是难以获得足量的
、
稳定的且有活性的膜蛋白
。
[0003]最简单的方法是构建包含膜蛋白胞外肽段的融合蛋白，该方法适合
Secretin
膜蛋白和
Adhesion
膜蛋白家族，该家族成员蛋白
N
端胞外大且有重要的配体结合位点
。
但该方法制备的膜蛋白无法模拟蛋白的天然构象，表位遗漏或失真，并不适合多次跨膜蛋白
。
为了得到最接近天然蛋白的全长跨膜蛋白，科学家们创造了一系列卓越的类膜结构，包括脂质体
liposomes
和纳米圆盘r/>nanodiscs。
其中，
liposomes
制备批间差不稳定，组装入
liposomes
中的膜蛋白通常会导致样品浑浊和粘稠，这可能会限制一些生物化学分析技术的应用
。Nanodiscs
组装的膜蛋白更接近天然构象，但其制备方法复杂，产量很低，价格昂贵
。
[0004]人类免疫缺陷病毒
1(human immunodeficiency virus type 1,HIV
‑
1)
是逆转录病毒科的慢病毒，是获得性免疫缺陷综合症
(AIDS)
的病原体
。HIV
‑1是一种包膜病毒，是具有9个功能基因的小
RNA
基因组
(9.7kb)
，包含3个结构基因
(gag,pol,env)
，2个调节基因
(tat,rev)
和4个辅助基因
(vif,vpu,vpr,nef)。
病毒样颗粒
(Virus
‑
Like Particles
，简称
VLPs)
是模仿病毒结构的自组装颗粒，是由病毒的核心结构蛋白
(gag)
自组装的亚病毒颗粒，该蛋白具有在宿主细胞膜上自组装的固有特性，从而向细胞培养基释放大分子复合物
。
但是，它们不包含病毒基因组，因此是非感染性的
。

技术实现思路

[0005]针对现有技术中的不足，本专利技术旨在提供一种利用病毒样颗粒制备膜蛋白的新方法，该方法不仅操作简单
、
批间差小，而且产量高，所得蛋白也最接近膜蛋白天然构象
。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术的技术方案具体如下：
[0007]一种利用病毒样颗粒制备膜蛋白的方法，包括以下步骤：
[0008]S1、
分别构建
Gag
表达质粒和膜蛋白表达质粒，所述
Gag
表达质粒中含有编码
gag
蛋白的序列，所述膜蛋白表达质粒中含有编码目标膜蛋白的序列；
[0009]S2、
将
Gag
表达质粒和膜蛋白表达质粒共转染细胞，培养所述细胞；
[0010]S3、
收集细胞培养液，取上清，纯化，得到病毒样颗粒；所述病毒样颗粒包含
gag
蛋白和目标膜蛋白，所述
gag
蛋白的氨基酸序列如
SEQ ID NO.1
所示
。
[0011]在上述制备膜蛋白的方法中，所述目标膜蛋白可以为外周膜蛋白
(
膜外在蛋白
)
，也可以为跨膜蛋白
(
膜内在蛋白
)
，还可以为脂锚定蛋白
。
作为优选地，本专利技术提供的制备方法尤其适用于跨膜蛋白的制备，所得膜蛋白能够模拟蛋白的天然构像，且产量高
。
[0012]在本专利技术一个实施例中，跨膜蛋白具体为四次跨膜蛋白
CLDN18.2
，其氨基酸序列如
SEQ ID NO.2
所示；所得病毒样颗粒包膜结构完整，且
ELISA
活性检测结果表明，该病毒样颗粒与
CLDN18.2
药物抗体具有良好的结合活性
。
[0013]在本专利技术另一实施例中，跨膜蛋白为四次跨膜蛋白
CLDN6
，其氨基酸序列如
SEQ ID NO.3
所示；所得病毒样颗粒包膜结构完整，且
ELISA
活性检测结果表明，该病毒样颗粒与
CLDN6/9
重组抗体具有良好的结合活性
。
[0014]在本专利技术另一实施例中，跨膜蛋白为四次跨膜蛋白
CLDN9
，其氨基酸序列如
SEQ ID NO.4
所示；所得病毒样颗粒包膜结构完整，且
ELISA
活性检测结果表明，该病毒样颗粒与
CLDN6/9
重组抗体具有良好的结合活性
。
[0015]在本专利技术另一实施例中，跨膜蛋白为四次跨膜蛋白
CCR8
，其氨基酸序列如
SEQ ID NO.5
所示；所得病毒样颗粒包膜结构完整，且
ELISA
活性检测结果表明，该病毒样颗粒与
CCR8
重组抗体具有良好的结合活性
。
[0016]在上述制备膜蛋白的方法中，所述细胞为哺乳动物细胞，且哺乳动物细胞包括但并不限于
HEK293F
细胞
、CHO
细胞
、
已经构建好表达膜蛋白的稳转细胞株等
。
[0017]在本专利技术一实施例中，所用哺乳动物细胞为
HEK293F
细胞，待将
HEK293F
细胞培养至处于指数期后，即可利用转染试剂将两种质粒转染至细胞
。
[0018]在上述制备膜蛋白的方法中，
Gag
表达质粒和膜蛋白表达质粒可通过本领域常规方法将目标
DNA
分子
(
即编码
gag
蛋白的序列和编码目标膜蛋白的序列
)
或含有所述...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种利用病毒样颗粒制备膜蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、
分别构建
Gag
表达质粒和膜蛋白表达质粒，所述
Gag
表达质粒中含有编码
gag
蛋白的序列，所述膜蛋白表达质粒中含有编码目标膜蛋白的序列；
S2、
将
Gag
表达质粒和膜蛋白表达质粒共转染细胞，培养所述细胞；
S3、
收集细胞培养液，取上清，纯化，得到病毒样颗粒；所述病毒样颗粒包含
gag
蛋白和目标膜蛋白，所述
gag
蛋白的氨基酸序列如
SEQ ID NO.1
所示
。2.
根据权利要求1所述利用病毒样颗粒制备膜蛋白的方法，其特征在于，所述目标膜蛋白为跨膜蛋白
。3.
根据权利要求2所述利用病毒样颗粒制备膜蛋白的方法，其特征在于，所述跨膜蛋白的氨基酸序列如
SEQ ID NO.2
～5中任一所示
。4.
根据权利要求1所述利用病毒样颗粒制备膜蛋白的方法，其特征在于，所述细胞为哺乳动物细胞
。5.
根据权利要求4所述利用病毒样颗粒制备膜蛋白的方法，其特征在于，所述哺乳动物细胞为
HEK293F。6.
根据权利要求1所述利用病毒样颗粒制备膜蛋白的方法，其特征在于，步骤
S1
采用
pSecTag2A
载体分别构建所述

【专利技术属性】
技术研发人员：王静，易汪雪，段双丽，雷文丽，于倩，茹志莹，
申请(专利权)人：武汉华美生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：