【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于杂交瘤，具体涉及一种杂交瘤细胞高效融合的方法。
技术介绍
1、杂交瘤技术的基本原理是通过融合两种细胞而同时保持两者的主要特征。这两种细胞分别是经抗原免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞，被特异性抗原免疫的小鼠脾细胞(b淋巴细胞)的主要特征是它的抗体分泌功能，但不能在体外连续培养，小鼠骨髓瘤细胞则可在培养条件下无限分裂、增殖，即具有所谓永生性。在选择培养基的作用下，只有b淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交细胞才能具有持续培养的能力，形成同时具备抗体分泌功能和保持细胞永生性两种特征的细胞克隆。
2、在杂交瘤技术中，小鼠骨髓瘤细胞和脾细胞的活性状态对细胞融合过程以及融合后的杂交瘤生长有着至关重要的作用。小鼠骨髓瘤细胞是成熟的瘤细胞，经过多次传代培养活化。在某些细胞生长分裂的过程中，会向培养基中释放氧自由基，氧自由基积累至一定程度后，会破坏细胞膜和细胞器膜，从而杀死细胞，使得细胞达不到较高的密度。另外，脾细胞是从小鼠脾脏中通过过滤网磨碎脾脏得到的细胞，在此过程中，一方面会损失一些脾细胞，另一方面对部分细胞有一定的物理损失，再去融合后，会让融合成功的有损伤的脾细胞无法生长起来。这些因素都限制了杂交瘤细胞的融合效率，从而使得研究项目失败风险大且研发周期长。
3、杂交瘤技术被广泛用于各种单克隆抗体的制备，单克隆抗体不仅在生物学和免疫学基础研究中具有重要的价值，而且在实践中的应用范围也极为广泛。因此，开发杂交瘤细胞高效融合的方法具有重要意义。
技术实现思路
1、有鉴于
2、为了实现上述目的，本专利技术的技术方案具体如下：
3、一种杂交瘤细胞高效融合的方法，具体包括以下步骤：
4、s1、用培养基a培养小鼠骨髓瘤细胞后，再用培养基b对小鼠骨髓瘤细胞进行预处理以调整其表面电荷；其中，所述培养基a中含有用于中和掉小鼠骨髓瘤细胞释放的氧自由基的还原剂，所述培养基b以10-20％v/v胎牛血清+80-90％v/v dmem为基础培养基，外加终浓度为0.8-1.2％wt的谷氨酰胺和6000-9000mg/l的无机钠盐，所述培养基b中含有300-400mg/l的无机钾盐；
5、s2、用含有白细胞介素6(il-6)和白细胞介素2(il-2)的培养基c预培养小鼠脾细胞；
6、s3、将s1所得小鼠骨髓瘤细胞与s2所得小鼠脾细胞融合。
7、优选地，在上述方法中，所述还原剂为β巯基乙醇。
8、更为优选地，在上述方法中，所述培养基a的组成为：以10-20％v/v胎牛血清+80-90％v/v dmem为基础培养基，外加终浓度为0.8-1.2％wt的谷氨酰胺和0.35％-4.5％v/v的β巯基乙醇。
9、优选地，在上述方法中，所述无机钠盐包括氯化钠和/或碳酸钠，所述无机钾盐包括氯化钾。
10、优选地，在上述方法中，所述培养基c的组成为：以10-20％v/v胎牛血清+80-90％v/v dmem为基础培养基，外加终浓度为0.8-1.2％wt的谷氨酰胺、50-60ng/l il-6和100-120μg/ml il-2。
11、优选地，在上述方法中，所述小鼠骨髓瘤细胞为sp2/0细胞株。
12、优选地，在上述方法中，步骤s1所述培养基a的培养时间为1-2天，所述培养基b的预处理时间为0.5-1h。
13、优选地，在上述方法中，步骤s2预培养小鼠脾细胞的时间为1-2天。
14、优选地，在上述方法中，步骤s3所述的小鼠骨髓瘤细胞与脾细胞于peg中融合，且所述peg的分子量为1000-4000。
15、相对于现有技术，本专利技术的有益效果为：
16、本专利技术方法通过在小鼠骨髓瘤的培养基中添加能够中和掉氧自由基的还原剂，使得细胞分裂到很高的密度而不死亡，从而有效改善了小鼠骨髓瘤细胞活性；同时，本专利技术采用含有高浓度钠离子的培养液预处理小鼠骨髓瘤细胞，改变了小鼠骨髓瘤细胞表面电荷，进而减少了融合过程中小鼠骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞的排斥作用，增加了融合过程中粘度，提高了融合效率；另外，本专利技术方法在进行融合处理前，采用添加有il-6和il-2的培养基预培养小鼠脾细胞，使得脾细胞不仅能够快速增殖，提高了脾细胞数量，同时也修复在脾脏处理成脾细胞这一过程中的物理损伤，进一步提升了融合效率，对阳性率也有积极作用。
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1.一种杂交瘤细胞高效融合的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述杂交瘤细胞高效融合的方法，其特征在于，所述还原剂为β巯基乙醇。
3.根据权利要求2所述杂交瘤细胞高效融合的方法，其特征在于，所述培养基A的组成为：以10-20％v/v胎牛血清+80-90％v/v DMEM为基础培养基，外加终浓度为0.8-1.2％wt的谷氨酰胺和0.35％-4.5％v/v的β巯基乙醇。
4.根据权利要求1所述杂交瘤细胞高效融合的方法，其特征在于，所述无机钠盐包括氯化钠和/或碳酸钠，所述无机钾盐包括氯化钾。
5.根据权利要求1所述杂交瘤细胞高效融合的方法，其特征在于，所述小鼠骨髓瘤细胞为SP2/0细胞株。
6.根据权利要求1所述杂交瘤细胞高效融合的方法，其特征在于，所述培养基C的组成为：以10-20％v/v胎牛血清+80-90％v/v DMEM为基础培养基，外加终浓度为0.8-1.2％wt的谷氨酰胺、50-60ng/L IL-6和100-120μg/mL IL-2。
7.根据权利要求1所述杂交瘤细胞高效融合的方法
8.根据权利要求1所述杂交瘤细胞高效融合的方法，其特征在于，在步骤S1中，所述培养基B的预处理时间为0.5h-1h。
9.根据权利要求1所述杂交瘤细胞高效融合的方法，其特征在于，在步骤S2中，预培养小鼠脾细胞的时间为1-2天。
10.根据权利要求1所述杂交瘤细胞高效融合的方法，其特征在于，在步骤S3中，所述小鼠骨髓瘤细胞与脾细胞于PEG中融合，且所述PEG的分子量为1000-4000。
...【技术特征摘要】
1.一种杂交瘤细胞高效融合的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述杂交瘤细胞高效融合的方法，其特征在于，所述还原剂为β巯基乙醇。
3.根据权利要求2所述杂交瘤细胞高效融合的方法，其特征在于，所述培养基a的组成为：以10-20％v/v胎牛血清+80-90％v/v dmem为基础培养基，外加终浓度为0.8-1.2％wt的谷氨酰胺和0.35％-4.5％v/v的β巯基乙醇。
4.根据权利要求1所述杂交瘤细胞高效融合的方法，其特征在于，所述无机钠盐包括氯化钠和/或碳酸钠，所述无机钾盐包括氯化钾。
5.根据权利要求1所述杂交瘤细胞高效融合的方法，其特征在于，所述小鼠骨髓瘤细胞为sp2/0细胞株。
6.根据权利要求1所述杂交瘤细胞高效融合的方法，其特征在于，所述培养基c...
【专利技术属性】
技术研发人员：张芳，易汪雪，李晶晶，王婷，周文祥，
申请(专利权)人：武汉华美生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：
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