25‑羟基维生素D3测定试剂盒及制作方法技术

本发明专利技术涉及医学免疫学中荧光免疫层析技术领域，具体地说是一种25‑羟基维生素D3测定试剂盒及制作方法，设有试纸卡，其特征在于所述试纸卡由下至上依次设有：PVC板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中结合垫上吸附有稀土Eu

Kit and preparing method for the determination of 25 hydroxy vitamin D3

The present invention relates to medical immunology fluorescence immunochromatographic technology field, in particular to a 25 hydroxyitamin D3 assay kit and a preparation method thereof, a test card, which is characterized in that the test card followed by the bottom is provided with a PVC plate, a sample pad, combination pad, nitrate cellulose membrane and absorbent pad. The combined pad adsorbed rare earth Eu

【技术实现步骤摘要】
25-羟基维生素D3测定试剂盒及制作方法
：本专利技术涉及医学免疫学中荧光免疫层析
，包括蛋白交联技术、膜层析技术、标记免疫分析技术等。具体地说是一种能够快速准确的对血清、血浆和全血等样品中25-羟基维生素D3进行定量分析的25-羟基维生素D3测定试剂盒及制作方法。
技术介绍
：VD系类固醇的衍生物是促进机体钙磷吸收的主要元素，在自然界中以10多种形式存在，维生素的两个最重要的形式是维生素D3和维生素D2，对动物最有营养意义。而VD在体内仅是其活性代谢物的前体，只有转化为25-羟基D3(25-OH-D3)和1,25-二羟基D3(1,25-(OH)2D3)后才有生物活性，才能有效地发挥其生理生化功能。25-OH-D3是维生素D在体内的主要活性产物，是评价维生素D营养水平及诊断佝偻病可靠而敏感的指标。25-OH-D3的重要生理功能是调节机体Ca,P的正常代谢，维持动物血钙、血磷水平,保持骨骼的正常生长发育,防止钙缺乏症,如软骨病、佝偻病等。在人体内，维生素D3和D2与血浆中维生素D结合蛋白结合，并转运到肝脏，两者经25羟基化成为25羟基维生素D，在血清中检测出来的95％以上的25羟基维生素D为25羟基维生素D3，维生素D缺乏是继发性甲状旁腺机能亢进症的常见病因。提高甲状旁腺激素含量，特别是提高缺乏维生素D的老年人的甲状旁腺激素含量会导致骨软化症，增加了骨转化，降低了骨质量，并有骨折的危险。25-羟基维生素D3含量低还与骨密度低有关。与其他临床数据结合，其结果可作为辅助手段来判定骨代谢。免疫分析技术是利用微量抗原与相应的高特异性抗体之间的免疫反应，来检测如激素、药物、蛋白质、多肽、酶、肿瘤相关抗原、微生素、病毒、细菌及金属元素等生物体内活性物质。免疫分析技术包括标记免疫分析、非标记免疫分析和仪器免疫分析。本试剂盒利用的含有稀土元素的羧基乳胶微球标记免疫分析技术是属于标记免疫分析之一种。荧光免疫分析(FIA)和放射免疫分析(RIA)自问世以来，经历了几十年的发展，但是人们越来越感觉到FIA因自然本地太高，干扰检测结果；RIA采用同位素标记，对人体有极大危害并给实验带来不便。酶免疫分析(EIA)也因酶本身不稳定，受其他影响因素较大，推广应用受到限制。80年代初，人们开始研究用稀土元素代替荧光物质和同位素标记蛋白质或抗体，将时间分辨技术引入到生物检测领域，建立了新型的超微量时间分辨荧光免疫分析技术(TimeresolvedFluoroimmunoassay，简称TrFIA)。该技术采用多学科先进技术，集结了其他免疫分析的特点，在免疫学、分子生物学、细胞学和医学等领域，取得长足的发展和广泛应用。TrFIA利用了具有独特荧光特性的3价稀土离子及螯合物为示踪物代替荧光物质、酶、同位素、化学发光物质，标记抗体、抗原、激素、多肽、蛋白质、核酸探针及生物细胞，待反应体系(如抗原抗体反应、核酸探针杂交、生物素亲和素反应以及靶细胞对效应细胞的杀伤效应等)发生后，用TrFIA检测仪测定反应产物中的荧光强度。根据产物荧光强度和相对荧光强度的比值，判断反应体系中分析物的浓度，从而达到定量分析。在通常的荧光测定中，由于测试样品中含有多种荧光成分，背景荧光(来自样品中的胶体颗粒和溶剂分子引起的散射光以及血清中蛋白质和其他化合物发出的非特异性荧光)强度大、干扰强，成为荧光分析法大范围推广的瓶颈。TrFIA之所以能够成为继EIA、RIA之后一种新的灵敏的检测方法，主要取决于镧系元素独特的荧光特点、检测中采用的波长分辨和时间延迟技术以及解离-增强技术。镧系元素(lanthanide,Ln)属于稀土元素，共有17中，常用于TrFIA主要有铕(Eu)、钐(Sm)、铽(Tb)、镝(Dy)。镧系元素具有独特的荧光发光特点，与普通荧光相比，镧系离子螯合物荧光衰变时间长，为传统荧光的103-106倍。如镧系离子螯合物的荧光衰变时间在60-900μs，常用的Eu3+荧光衰变时间为714μs，普通荧光免疫分析中荧光团的荧光衰变时间只有1-100μs，样品中一些蛋白质的荧光衰变时间仅为1-10μs，因此利用时间分辨技术，延迟一定时间后测量，便可获得Eu3+特异性荧光信号。同时由于衰变时间长，Eu3+标记物在测量时间里可以反复被激发，每次激发后由激发态很快跃迁到基态，就有荧光发出，然后又可被重新激发，如此每秒可有1000次激发，使得TrFIA荧光标记物的相对比活性很高。镧系元素荧光光谱的最大特征是激发光与发射光之间的Stokes位移较大，Eu3+激发波长为337nm，发射波长为615nm，Stokes位移可达278nm；同时Eu3+被激发的荧光光带极窄，荧光的发射峰非常尖锐，可使仪器调整在极窄的波长范围内测定，这样就几乎完全消除了背景荧光的干扰，继而通过时间延迟和波长分辨，将强特异性荧光和背景荧光辨开(故称为时间分辨)，使干扰达到几乎为零。鉴于以上标记方法及检测技术的应用，本试剂盒具有良好的检测特异性、较高的灵敏度、操作的简便性以及稳定的荧光标记物保证了检测的准确性。
技术实现思路
：本专利技术针对现有技术中存在的缺点和不足，提出了一种利用荧光免疫层析的灵敏性，结合荧光免疫层析分析仪实现的灵敏度高、快捷简便，可以准确定量的25-羟基维生素D3测定试剂盒及制作方法。本专利技术可以通过以下措施达到：一种25-羟基维生素D3测定试剂盒，设有试纸卡，其特征在于所述试纸卡由下至上依次设有：PVC板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中结合垫上吸附有稀土荧光微球标记的抗25-羟基维生素D3单克隆抗体-微球偶联复合物，所述稀土荧光微球的直径为100-250nm，稀土荧光微球含稀土镧系元素中的一种或几种，在基态下稳定，在300-400nm的激发光源作用下发射出波长范围为550-650nm的荧光；所述单克隆抗体为纯化后混合的单克隆抗体，来源于针对2-6个不同的25-羟基维生素D3抗原表位的单克隆抗体细胞株。本专利技术所述结合垫的稀土荧光微球的直径优选是150-200nm；所述稀土荧光微球优选含有一种或几种稀土镧系元素；结合垫上稀土荧光微球标记的抗体优选来源于针对2个不同抗原表位的单克隆细胞细胞株。本专利技术所述结合垫采用如下步骤制得：将玻璃纤维膜浸泡于150mMTris-HCL处理液中(含1.0％TritonX-100，2.5％BSA，pH7.4)，4℃浸泡2小时，然后取出37℃烘箱烘干4小时，备用，将玻璃纤维膜放在Bio-DotXYZ3050三维喷点平台上，用Bio-JetQuanti300非接触式微定量喷头将稀土荧光微球标记的抗25-羟基维生素D3单克隆抗体偶联复合物喷到玻璃纤维膜，37℃烘干1小时后制得。本专利技术中结合垫上的所述稀土荧光微球标记的抗25-羟基维生素D3单克隆抗体采用如下步骤制得：步骤1：单克隆抗体细胞株的获得：用25-羟基维生素D3纯品免疫小鼠，采用标准的单克隆抗体制备方法制备特异性高亲和力的单克隆抗体细胞株，对所获得的单抗细胞株进行配对筛选，根据配对结果和亲和力数据选出用于试剂盒的单抗细胞株；步骤2：单克隆抗体的制备：采用标准的腹水生产工艺制备并纯化抗25-羟基维生素D3单克隆抗体，分装后保存于-20℃备用；步骤3：稀土荧光微球的醛基化：取5mg稀土荧光微球本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种25‑羟基维生素D3测定试剂盒，设有试纸卡，其特征在于所述试纸卡由下至上依次设有：PVC板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中结合垫上吸附有稀土荧光微球标记的抗25‑羟基维生素D3单克隆抗体‑微球偶联复合物，所述稀土荧光微球的直径为100‑250nm，稀土荧光微球含稀土镧系元素中的一种或几种，在基态下稳定，在300‑400nm的激发光源作用下发射出波长范围为550‑650nm的荧光；所述单克隆抗体为纯化后混合的单克隆抗体，来源于针对2‑6个不同的25‑羟基维生素D3抗原表位的单克隆抗体细胞株。

【技术特征摘要】
1.一种25-羟基维生素D3测定试剂盒，设有试纸卡，其特征在于所述试纸卡由下至上依次设有：PVC板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中结合垫上吸附有稀土荧光微球标记的抗25-羟基维生素D3单克隆抗体-微球偶联复合物，所述稀土荧光微球的直径为100-250nm，稀土荧光微球含稀土镧系元素中的一种或几种，在基态下稳定，在300-400nm的激发光源作用下发射出波长范围为550-650nm的荧光；所述单克隆抗体为纯化后混合的单克隆抗体，来源于针对2-6个不同的25-羟基维生素D3抗原表位的单克隆抗体细胞株。2.根据权利要求1所述的一种25-羟基维生素D3测定试剂盒，其特征在于所述结合垫的稀土荧光微球的直径范围是150-200nm；所述稀土荧光微球掺杂有稀土镧系元素Eu3+，结合垫上稀土荧光微球标记的抗体来源于针对2个不同抗原表位的单克隆细胞细胞株。3.根据权利要求1所述的一种25-羟基维生素D3测定试剂盒，其特征在于所述结合垫采用如下步骤制得：将玻璃纤维膜浸泡于150mMTris-HCL处理液中(含1.0％TritonX-100，2.5％BSA，pH7.4)，4℃浸泡2小时，然后取出37℃烘箱烘干4小时，备用，将玻璃纤维膜放在Bio-DotXYZ3050三维喷点平台上，用Bio-JetQuanti300非接触式微定量喷头将稀土Eu3+荧光微球标记的抗25-羟基维生素D3单克隆抗体偶联复合物喷到玻璃纤维膜，37℃烘干1小时后制得。4.根据权利要求1所述的一种25-羟基维生素D3测定试剂盒，其特征在于结合垫上的所述稀土荧光微球标记的25-羟基维生素D3单克隆抗体采用如下步骤制得：步骤1：单克隆抗体细胞株的获得：用25-羟基维生素D3纯品免疫小鼠，采用标准的单克隆抗体制备方法制备特异性高亲和力的单克隆抗体细胞株，对所获得的单抗细胞株进行配对筛选，根据配对结果和亲和力数据优选出用于试剂盒的单抗细胞株；步骤2：单克隆抗体的制备：采用标准的腹水生产工艺制备并纯化25-羟基维生素D3单克隆抗体，分装后保存于-20℃备用；步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：王鹏浩，陈萍萍，宋璐琳，王文亮，刘衍亮，于鸿翔，
申请(专利权)人：威海纽普生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37