本发明专利技术为一种采用高效液相色谱-荧光检测器(HPLC-FLD)法检测不同基质中药材及其制品中桔青霉素的方法，包括样品的提取，纯化及检测。所述的样品采用甲醇-水(70∶30，V/V)高速震荡提取，离心，过滤，加PBS溶液稀释，微纤维膜过滤，免疫亲和柱净化后，收集洗脱液，微孔滤膜过滤后进样分析。样品经液相色谱-串联质谱进行确证。本方法适用于各种不同基质中药材及其制品中桔青霉素的检测，操作简便，回收率高，检测限低。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种测定不同基质中药材及其制品中桔青霉素的方法，特别是涉及采用高效液相色谱-荧光检测器测定桔青霉素的方法，高效液相色谱-串联质谱法确证中药材及其制品中桔青霉素的方法。
技术介绍
桔青霉素是青霉属(Penicillium)、曲霉属(Aspergillus)、红曲霉属(Monascus)中的丝状霉菌代谢产生的一种真菌毒素。最初是1931年从青霉属中的桔青霉(Penicillium. citrinum)中分离得到，其它已知的能产生桔青霉素的菌种如变灰青霉(P. canescens)、扩展青霉(P. expansum)、闪白曲霉(Aspergillus candidus)、黄柄曲霉(A. flavipes)、紫红曲霉(Monascus purpureus)、红曲霉(M. ruber)等。主要污染谷物、食品及饲料，对人畜危害都较大，它作用的靶器官是肾脏，人和动物如摄入被桔青霉素污染的产品后，可引起肾脏肿大、尿量增多、肾小管扩张和上皮细胞变性坏死等症状，甚至还可以导致畸形、肿瘤，诱发突变。桔青霉素在自然界分布极为广泛，小麦、大麦、燕麦、麦麸、玉米及红曲类污染桔青霉素都有相关报道，并且对红曲类产品的调查结果显示桔青霉素的污染水平普遍较高，不难发现部分药食两用的中药材受桔青霉素的污染相当普遍，如麦芽、谷芽、麦麸、红曲等。1991年在法国里昂召开的真菌毒素和地方肾病与泌尿道肿瘤研讨会上，讨论了桔青霉素在Balcan地方肾病发生中的作用，引起了国际癌症研究会及各国学者的高度重视。国家药监局在红曲等为原料保健食品产品申报与审评有关事项中增加产品中桔青霉素指标的测定限量暂定为50 μ g/kg。因此，为保证中药的安全有效，需尽快建立相关中药材及其制品中快速、准确的桔青霉素检测方法，完善我国中药安全控制标准体系，以提高我国在中药安全国际标准制定中的地位。
技术实现思路
到目前为止，国内外报道的方法大多仅限于对中药材红曲米中桔青霉素的分析，对其他不同基质的中药材及其制品中桔青霉素的分析，目前还是空白。因此对大范围中药材中桔青霉素测定方法的建立迫在眉睫。现有的测定农产品、饲料以及红曲类产品中的桔青霉素的方法，由于样品基质相对简单，除红曲类产品会产生色素成分干扰外，其它因素干扰较小，一般都较易测定。本专利技术克服现有技术不足，选择了适用于不同基质中药材及其制品中桔青霉素的提取、净化方法，以及采用有较高灵敏度的高效液相-荧光检测法，通过方法的优化，保证样品处理简便易行，含量测定结果准确度高，重现性好，故采用该方法能更加准确的对不同基质中药材及其制品中的桔青霉素进行测定。本专利技术是采用高效液相色谱-荧光检测法测定中药材及其制品中的桔青霉素的方法，同时还建立了高效液相色谱-串联质谱法确证中药材及其制品中桔青霉素的方法。具体的不同基质中药中桔青霉素测定的方法，可以通过以下步骤实现5仪器、药品及材料仪器SHIMADZU LC-20AT高效液相色谱仪、RF-IOAxL检测器，日本岛津公司；TGL-16C型高速离心机，上海安亭科学仪器厂；WH-861型旋涡混合器，金坛市盛蓝仪器制造有限公司；DHG-9030A型电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；CitriiTest-HPLC 免疫亲和柱，美国 VICAM 公司；微纤维膜滤纸，美国VICAM公司；API4000液相质谱联用系统，美国应用生物系统公司。对照品桔青霉素标准品购自！^rmentek公司，纯度彡99% ；乙腈、甲醇购自Fisher公司，均为色谱纯；水为重蒸水；其余试剂均为分析纯。样品所有样品均为国内市场上随机购买而来，低温干燥后备用。1、高效液相色谱-荧光检测法测定不同基质中药及其制品中的桔青霉素a.色谱条件采用反相C18液相色谱柱，荧光检测器检测，流动相为乙腈-0. 磷酸水(45 55，ν/ν)，检测器激发波长为331nm，发射波长为500nm。b.溶液配制对照品溶液的配制分别称取对照品适量，加乙腈或甲醇制成溶液；c.样品溶液的制备样品提取取药材粉末，置具塞锥形瓶中，加甲醇-水溶液适量，高速震荡提取，离心，过滤，稀释，震摇，静置，再震摇，再静置，微纤维膜过滤，备用；样品净化取上述滤液缓慢通CitriTest-HPLC免疫亲和柱，直至空气通过柱体，再以缓冲溶液淋洗免疫亲和柱，弃去全部流出液，并使空气通过柱体。甲醇水洗脱，收集洗脱液，过滤后进HPLC分析。d.测定法分别精密吸取对照品和样品溶液，注入液相色谱仪，测定。2、高效液相色谱-串联质谱法确证中药中的桔青霉素a.色谱条件流动相为乙腈-水，梯度洗脱。色谱柱为Gemini C18色谱柱。b.质谱条件离子源为电喷雾离子源，正离子方式检测，喷射电压为5500V，毛细管温度550°C，碰撞能量23/36eV，扫描方式为多反应监测(MRM)。c.测定法分别精密吸取对照品和样品溶液，注入液相色谱-串联质谱仪，测定。本专利技术不同基质中桔青霉素的测定方法，优选的技术方案可以按下列测定步骤进行1、高效液相色谱-荧光检测法测定不同基质中药及其制品中的桔青霉素(1)色谱条件高效液相色谱仪(HPLC-FLD) SHIMADZU LC-20AT系列，RF-IOAxL荧光检测器；色谱柱Gemini5u C18 IlOA (250 X 4. 60mm)；流动相乙腈-0. 磷酸水(45 55，ν/ν)；柱温25°C；流速1. Oml/min ；激发波长=331nm，发射波长=500nm。(2)溶液配制对照品溶液的配制精密称取桔青霉素对照品适量，加甲醇制成每ml含^g的溶液；PBS稀释液称取8. Og氯化钠，1. 2g磷酸氢二钠，0. 2g磷酸二氢钾，0. 2g氯化钾，用990ml纯水溶解，然后用浓盐酸调节值至7. 0，最后用纯水稀释至1000ml。PBS-吐温淋洗液(0. 05% )取0. 5ml吐温-20，加入PBS缓冲溶液并定容至1000ml。(3)样品溶液的制备样品提取精密取药材粉末l.Og，置具塞锥形瓶中，加甲醇-水溶液(70 30, V/V) 5ml，高速震荡提取3min，6000r/min的转速下离心20min，过滤，取3ml滤液加PBS稀释液稀释至30ml，震摇lmin，静置2min，再震摇lmin，静置3min，微纤维膜过滤，备用。样品净化取上述滤液2ml以1滴/秒的速度缓慢通过CitriTest-HPLC免疫亲和柱，直至2-3ml空气通过柱体，再以IOml 0. 05% PBS-吐温溶液淋洗免疫亲和柱，弃去全部流出液，并使2-3ml空气通过柱体。准确加入2. OmL甲醇-磷酸水(70 30，V/V)洗脱，收集洗脱液定容过滤备用。(4)测定法分别精密吸取对照品和样品溶液50 μ L，注入液相色谱仪，测定桔青霉素含量。2、高效液相色谱-串联质谱法确证不同基质中药材及制品中的桔青霉素(1)色谱条件流动相A为水(含0.1%甲酸)，流动相B为乙腈(含0.1%甲酸)。梯度 0. 01-0. 60min,90 % A ；0. 60-1. 20min,90 % A-5 % A ；1. 20-2. 50min,5 % A ；2. 50-2. 51min,5% A-90% A ；2. 51-4. 00min,90% Α。色谱柱为 Gemin本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨美华，李燕，
申请(专利权)人：中国医学科学院药用植物研究所，
类型：发明
国别省市：
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