具有免疫佐剂作用的皂苷及其制备方法和含该皂苷为佐剂的疫苗制剂及用途技术

本发明专利技术涉及具有免疫佐剂作用的皂苷及其制备方法和含该皂苷为佐剂的疫苗制剂，以及它们在预防和治疗人兽传染性疾病和癌症中的应用。该皂苷是从中药桔梗中提取分离的桔梗皂苷Ｄ、桔梗皂苷Ｄ２和包含有这２种皂苷化合物的桔梗总皂苷，可诱生机体同时产生Ｔｈ１型和Ｔｈ２型免疫应答，且显示出比现有技术中已知的铝胶佐剂能诱导机体对疫苗产生更强的细胞免疫和体液免疫反应，可以作为多种疫苗的免疫佐剂，发挥理想的免疫效果。以该类皂苷为佐剂的疫苗制备工艺简单、方法简便、质量容易控制、使用方便、可冰冻保存。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及具有免疫佐剂作用的皂苷及其制备方法和含该皂苷为佐剂的的 疫苗制剂，以及它们在预防和治疗人兽传染性疾病和癌症剂中的应用。技术背景传统的疫苗一般多为全菌或全病毒制成，含有大量非免疫原性物质，这些物质除具有毒副作用外也有一定的佐剂作用，所以一般不需要外加佐剂。随着免疫学基础理论研究的不断深入，以及抗原提纯 技术和基因工程技术的迅速发展，出现了许多如基因疫苗、重组疫苗和合成肽 疫苗等新型疫苗。这些新型疫苗具有抗原纯度高、分子量小、特异性强、安全 性好等优点，但免疫原性较弱，需要用免疫佐剂(简称佐剂)来增强其免疫原 性或增强宿主对抗原的保护性应答。目前研究的免疫佐剂很多，如油佐剂、弗氏佐剂、微生物及其代谢产物、核 酸及其类似物、细胞因子、脂质体等，但由于存在不同程度的毒副作用或安全 隐患等一些不可避免的缺陷而难以实际应用。铝胶仍是人兽疫苗生产中应用最 广的佐剂，而且也是唯一通过FDA批准的人用疫苗佐剂。然而，铝胶佐剂存在 一些问题①主要通过诱导Th2型免疫应答产生抗体起保护作用，不能诱生 Thl型免疫应答和细胞介导的免疫反应，只适用于以抗体为主要保护性免疫的疫 苗；②对人免疫缺陷病毒、丙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒、流感病毒以及血吸 虫病、百日咳和伤寒等多种抗原无佐剂作用；(D可促进IgE抗体产生，容易诱 导机体产生过敏反应； 有局部反应，会形成肉芽肿，极个别可发生局部无菌 性脓肿；⑤因其理化性质特点，含铝胶疫苗怕冻，冻后铝胶容易变性；◎对 人、畜神经系统可能有影响。免疫佐剂可以决定免疫应答的类型，而不同免疫 应答类型对疫苗的免疫保护性有显著的影响。 Thl型免疫反应可介导细胞免疫应答，主要针对细胞内病原体 如病毒、寄生虫、肿瘤等产生保护性免疫。Th2型免疫反应主要介导体液免疫应 答，针对大多数细菌及特定的病毒性传染病能产生有效保护力，而对细胞内病 原体及恶性肿瘤细胞一般没有保护力。因此，铝胶佐剂已远远不能满足新型疫 苗发展的要求。皂苷是一类广泛存在于天然药物中的重要活性成分。自1951年发现皂苷能 增强机体对口蹄疫疫苗的免疫反应以来，其佐剂作用受到广泛的关注。研究最 多的是南美皂树(g"z7^'flsa/7o"w/flMolina)树皮中筛选到具有佐剂活性总皂苷 ——Quil A及其活性成分QS-21 。但Quil A存在严重的缺陷①溶血性强、毒副 作用大，可引起局部组织坏死，甚至全身不良反应和中毒。临床安全性评价结果表明QuilA用 于人不安全。目前除了用于为某些绝症设计的疫苗如癌症疫苗和人免疫缺陷病 重组疫苗等人用疫苗外，主要限用于口蹄疫疫苗、狂犬病疫苗等兽用疫苗。②其 主要活性成分如QS-21 、 QS-17、 QS-18和QS-7等分子结构中均存在酰基，易 水解，其去酰化水解产物失去诱导Thl型免疫应答及产生特异性CTL的能力， 只能引发Th2型免疫应答;③南美阜树资 源匮乏，总皂苷含量低，同时Quil A中单体化合物分子量大，化学结构十分复 杂，分离制备困难。因此，有必要进一步寻找高效、低毒、稳定的理想皂苷佐 剂。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一类用于疫苗的具有显著免疫佐剂作用的皂苷。 本专利技术的另一个目的是提供从中药桔梗中提取分离总皂苷及其化合物的方法。本专利技术的进一步目的是提供预防和治疗人兽传染性疾病和癌症的疫苗制剂。本专利技术的还有一个目的是提供上述皂苷化合物和总皂苷在制备预防和治疗 人兽传染性疾病和癌症的疫苗制剂中的应用。本专利技术具有免疫佐剂作用的皂苷包括从中药桔梗中提取分离的桔梗皂苷D、桔梗皂苷D2以及包含有这2种皂苷化合物的混合物——桔梗总皂苷。本专利技术提供的桔梗皂苷D、桔梗皂苷D2以及包含有这2种皂苷的混合物 ——桔梗总皂苷是从中药桔梗中提取分离的，制备方法包括以下步骤a. 将桔梗药材粉碎后，以乙醇提取；b. 浓縮乙醇提取液，以水混悬，用乙醚或石油醚萃取至醚液近无色。取水 层以水饱和的丁醇或戊醇萃取，合并萃取液，减压回收、浓縮，得到醇萃取物。c. 醇萃取物在大孔吸附树脂柱中进行色谱分离，以水和乙醇混合液进行梯 度洗脱；d. 硅胶薄层色谱检查洗脱液，具有相同斑点的洗脱液合并，浓縮，得到桔 梗总皂苷；e. 桔梗总皂苷再经硅胶(包括Rp-18、 Rp-8)或Sephadex LH-20柱色谱或 HPLC色谱，以洗脱剂洗脱、分离，得到桔梗皂苷D以及桔梗皂苷D2。上述步骤e中所说的洗脱剂为甲醇和水或乙腈和水或丙酮和水的混合物。 本专利技术的疫苗制剂包含有免疫有效量的桔梗皂苷D、桔梗皂苷D2或桔梗总皂苷为免疫佐剂，以及含有一种或多种药物学上可接受的载体。本专利技术的化合物和混合物可用于制备预防和治疗传染性疾病和肿瘤的疫苗制剂。上文所述药物学上可接受的载体是指药学领域的药用载体，如水、生理盐水、 葡萄糖、甘露醇、甘油、乙醇及其混合物等稀释剂和赋形剂。另外，该组合物 还可包括湿润剂、乳化剂、pH缓冲液，等等。本专利技术的疫苗制剂可以是溶液、混悬液或乳浊液形式，可通过口服、鼻吸入、 直肠、肠胃外或经皮给药的方式施用于需要接种的对象。本专利技术的疫苗制剂用 于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉齐U、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、 缓释微丸、固体分散体、包含物等，制成的液体制剂如混悬剂、乳剂、溶胶剂、 糖浆剂、合剂、溶液剂等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、水 或油性混悬剂、乳剂、冻干粉、脂质体、微囊、微球、纳米囊、纳米球等。优先的形式是注射用冻干粉及溶液。本专利技术的疫苗制剂可按照药学领域的任何常规生产方法制备。 疫苗制剂的典型单剂量可以根据制剂的形式而变化，并根据抗原种类、所需的抗体水平、接种对象的特异性及所需的免疫程序等各种因素进行确定。本专利技术的疫苗制剂中皂苷佐剂的量可为0.0 lpg lg/单剂量，优选为0.1 100 pg/单剂量。可以一次或多次施用。 本专利技术的优点本专利技术具有免疫佐剂作用的皂苷(包括桔梗皂苷D、桔梗皂苷D2以及包含 有这2种皂苷化合物的混合物)可诱生机体同时产生Thl型和Th2型免疫应答， 且显示出比现有技术中已知的铝胶佐剂能诱导机体对疫苗产生更强的细胞免疫 和体液免疫反应。因此，可以作为多种疫苗的免疫佐剂，发挥理想的免疫效果。 以该类皂苷为佐剂的疫苗制备工艺简单、方法简便、质量容易控制、使用方便、 可冰冻保存。该类皂苷成分的溶血性小和安全性好。 附图说明图l为桔梗总皂苷对HBsAg免疫小鼠血清中特异性抗体效价的影响 HBsAg:重组乙肝表面抗原；Ahim:铝胶；PGS:桔梗总皂苷；，<0.05, bP<0.01 和e尸O.OOl w HBsAg对照组；a尸0.05，卞<0.01和》<0.001 w铝胶对照组。图2为桔梗皂苷D对HBsAg免疫小鼠脾淋巴细胞增殖反应的影响HBsAg: 重组乙肝表面抗原；Alum:铝胶；PD:桔梗皂苷D。卞<0.05， V<0.01和 wHBsAg和铝胶对照组。图3为桔梗皂苷D对HBsAg免疫小鼠血清中特异性抗体效价的影响 HBsAg:重组乙肝表面抗原；Alum:铝胶；PD:桔梗皂苷D;》<0.05， Vo.01 和卞<0.001 w HBsAg对照组；d尸0.05,卞<0.01和><本文档来自技高网...

【技术保护点】
具有免疫佐剂作用的皂苷，其特征是从中药桔梗中提取分离的桔梗皂苷Ｄ、桔梗皂苷Ｄ２和包含有这２种皂苷化合物的桔梗总皂苷。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：孙红祥，胡松华，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]