【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，尤其是涉及crispr-cas13a系统在dna检测中的应用。
技术介绍
1、为抵抗外源性病毒或质粒等外源核酸的入侵干扰，细菌和古细菌进化出多种防御机制，基于规律间隔成簇短回文重复序列(clustered regularly interspersed shortpalindromic repeats，crispr)是重要的获得性免疫保护系统。crispr系统利用由crispr序列转录并经过加工处理的rna分子来引导相关cas蛋白在入侵外源核酸特异性切割，从而切除外源基因，保护自身。2012年，研究者发现cas9与单向导rna(sgrna)的结合能在体外靶向并切割dna序列，这为crispr-cas作为一种全新且高效的基因编辑技术奠定了基础。随着crispr基因编辑技术的不断发展，crispr-cas的应用逐渐扩大到分子检测领域。
2、2016年，crispr-cas9系统首次应用于开发核酸检测工具，随着更多crispr-cas系统的发现，用于核酸检测的crispr-cas工具箱得到了显著发展，特别是具有反式切割机制的crispr-cas12和crispr-cas13引入核酸检测系统具有里程碑意义。这两种系统通过分别识别dna和rna，激活非特异性地分别对ssdna和rna高效反式切割，展现出卓越的准确性和效率。仅数年时间，crispr-cas系统已广泛应用于核酸、小分子、蛋白质及其他靶标的检测。
3、crispr-cas13a属于第2类ⅵ型crispr-cas系统，cas13a蛋白呈双
4、现有的研究认为，crispr-cas13a效应复合物仅能将rna作为靶核酸底物，不能将dna作为靶核酸底物，这限制了crispr-cas13a的应用范围和增加了检测成本，有鉴于这些问题，提出本专利技术。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种的crispr-cas13a系统在dna检测中的应用及由此产生的核酸检测方法、试剂盒，该方法高效、检测结果准确、灵敏度高。
2、为了达到上述目的，本专利技术提供crispr-cas13a系统在dna检测中的应用。
3、在本专利技术的一些实施方案中，所述的crispr-cas13a系统包含cas13a蛋白序列和crrna序列，其中crrna序列包括直接重复序列dr和间隔序列spacer。
4、在本专利技术的一些实施方案中，所述的直接重复序列来源于crispr-lbucas13或crispr-lwacas13a系统。
5、在本专利技术的一些实施方案中，所述的cas13a蛋白序列来源于口腔纤毛菌(leptotrichia buccalis)和韦德纤毛菌(leptotrichia wadei)。
6、在本专利技术的一些实施方案中，所述的cas13a蛋白为lbucas13、lwacas13a。
7、在本专利技术的一些实施方案中，所述的lbucas13的氨基酸序列如seq id no.5所示。
8、在本专利技术的一些实施方案中，所述的lwacas13a的氨基酸序列如seq id no.19所示。
9、在本专利技术的实施方案中，所述的dna为任意长度的从生物样本中分离得到的多核苷酸。
10、所述的“生物样本”涵盖从细胞、细胞外物质、组织或多细胞生物体中获得的包含dna的任何样品，包括血液和生物来源(包含真核细胞、动物细胞、原核细胞、植物细胞等)的其他液体样本、固体组织样本，例如活检标本或组织培养物或者由其衍生的细胞及其子代，也包括临床样本例如养物中的细胞、细胞上清液、细胞裂解物、血清、血浆、生物流体(例如，脑脊液、支气管肺泡灌洗液、尿液、血液、血液部分(例如，血浆、血清)、痰等)以及组织样本。
11、所述的“分离”表明样本基本上富含目标核酸和/或其中目标核酸是部分或基本上纯的。“分离”表示已经将蛋白质或核酸通过提取、逆转录、扩增、合成或重组表达方式从其制备的环境中分离。
12、在本专利技术的一些实施方案中，所述的dna包括ssdna、dsdna、质粒dna。
13、在本专利技术中，所述的dna的可以是任何来源，包括但不限于病毒、细菌、寄生虫，例如可以为流感病毒病毒(例如，甲型流感病毒、乙型流感病毒)；嗜肝dna病毒(例如，乙型肝炎病毒(hbv))；疱疹病毒(例如，单纯疱疹病毒(hsv)、水痘带状疱疹病毒(vzv)、巨细胞病毒(cmv)、疱疹淋巴病毒)；腺病毒、痘病毒、细小病毒、病原性细菌、寄生虫等。
14、在本专利技术的一些实施方案中，所述的间隔序列根据待测dna序列进行设计得到，进一步地，所述间隔序列与待测dna序列互补配对。
15、进一步地，本专利技术中所述的间隔序列长度大于17nt。
16、在本专利技术的一些实施方案中，所述的间隔序列长度为大于20nt。
17、在本专利技术的一些实施方案中，所述的间隔序列长度为20nt、21nt、22nt、24nt、25nt、26nt、27nt、28nt。
18、在本专利技术的一些实施方案中，所述的间隔序列长度为20nt、23nt或28nt。
19、在本专利技术的一些实施方案中，所述的间隔序列长度通过3’端截短获得。
20、在本专利技术的一些具体实施方式中，所述dna样本来源于甲型流感病毒或乙型流感病毒，由甲型流感病毒或乙型流感病毒基因逆转录获得。
21、当所述dna样本来源于甲型流感病毒时，所述crrna的核苷酸序列选自如seq idno.1、seq id no.8、seq id no.9、seq id no.10、seq id no.11、seq id no.15、seq idno.16、seq id no.17、seq id no.18所示的序列中的任一条。
22、当所述dna样本来源于乙型流感病毒时，所述crrna的核苷酸序列如seq id no.6所示。
23、在本专利技术的一些实施方案中，所述crispr-cas13a系统中还包含rna探针，所述的rna探针上连接有荧光基团和荧光淬灭基团。
24、进一步地，所述rna探针5’端连接有荧光基团，3’端连接有淬灭基团标记。
25、所述的rna探本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.CRISPR-Cas13a系统在DNA检测中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述CRISPR-Cas13a系统包含Cas13a蛋白和crRNA序列，所述crRNA序列包括直接重复序列DR和间隔序列Spacer。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述直接重复序列来源于CRISPR-LbuCas13或CRISPR-LwaCas13a系统。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述Cas13a蛋白为LbuCas13、LwaCas13a中的任一种。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的LbuCas13的氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示；所述的LwaCas13a的氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述DNA来源于甲型流感病毒、乙型流感病毒、乙型肝炎病毒(HBV)、单纯疱疹病毒(HSV)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、巨细胞病毒(CMV)、疱疹淋巴病毒、腺病毒、痘病毒、细小病毒、病原性细菌、寄生虫中的一种或多种。
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8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的间隔序列与待测DNA序列互补配对。
9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的间隔序列长度大于17nt；优选地，所述间隔序列长度为大于20nt；更优选地，间隔序列长度为20nt、23nt或28nt。
10.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的CRISPR-Cas13a系统中还进一步包含连接有荧光基团和淬灭基团的RNA探针，用于产生荧光信号。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述的荧光基团为FAM、HEX、ROX、SIMA、FITC、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、Texas Red或LC RED460中的一种或多种；所述淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的一种或多种。
12.一种DNA检测试剂盒，包含上述权利要求1-11中任意一种CRISPR-Cas13a系统。
13.根据权利要求12所述的试剂盒，其特征在于还包含缓冲液、RNase抑制剂和参考染料。
14.使用权利要求1-11中任意一项中的CRISPR-Cas13a系统或权利要求12-13中任意一项中的试剂盒进行DNA检测的方法，其步骤为，将待测DNA样本与CRISPR-Cas13a/crRNA蛋白核酸复合物孵育反应，Cas13a蛋白切割荧光基团/淬灭基团标记RNA探针后，采集并分析荧光信号数据。
...【技术特征摘要】
1.crispr-cas13a系统在dna检测中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述crispr-cas13a系统包含cas13a蛋白和crrna序列，所述crrna序列包括直接重复序列dr和间隔序列spacer。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述直接重复序列来源于crispr-lbucas13或crispr-lwacas13a系统。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述cas13a蛋白为lbucas13、lwacas13a中的任一种。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的lbucas13的氨基酸序列如seq idno.5所示；所述的lwacas13a的氨基酸序列如seq id no.19所示。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述dna来源于甲型流感病毒、乙型流感病毒、乙型肝炎病毒(hbv)、单纯疱疹病毒(hsv)、水痘带状疱疹病毒(vzv)、巨细胞病毒(cmv)、疱疹淋巴病毒、腺病毒、痘病毒、细小病毒、病原性细菌、寄生虫中的一种或多种。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述dna为ssdna、dsdna、质粒dna中的一种或多种。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的间隔序列与待测dna序列...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴青，胡克平，
申请(专利权)人：中国医学科学院药用植物研究所，
类型：发明
国别省市：
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