一种实时监测蒽环类化疗药血药浓度的时间分辨免疫检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种实时监测蒽环类化疗药血药浓度的时间分辨免疫检测试剂盒。所述试剂盒包括校准品、校准品稀释液、铕标DOX‑OVA抗原、抗DOX/EPI多抗、洗涤液、增强液、分析缓冲液、羊抗鼠IgG包被反应板。本发明专利技术的试剂盒灵敏度高，灵敏度为3.8ng/ml，稳定性好，重复性好，省时高效，操作简便、检测范围宽、无放射性污染等特点，有利于化疗药物即时监测的实现，适合用于临床蒽环类药物血药监测，指导临床用药。

A time resolved immunoassay kit for real time monitoring of blood concentration of anthracycline drugs

The present invention discloses a time resolved immunoassay kit for monitoring blood concentration of anthracycline drugs in real time. The kit includes a calibrator calibrator, diluent, DOX europium OVA antigen, polyclonal anti DOX/EPI antibody, washing liquid, liquid, enhance analysis buffer, Goat anti mouse IgG coated reaction plate. The invention has high sensitivity kit, the sensitivity is 3.8ng/ml, good stability, good repeatability, high efficient, simple operation, wide detection range, no radioactive pollution, is conducive to the realization of real-time monitoring of chemotherapy drugs, suitable for clinical anthracycline drug blood test, to guide the clinical medication.

【技术实现步骤摘要】
一种实时监测蒽环类化疗药血药浓度的时间分辨免疫检测试剂盒
本专利技术涉及医学生物技术与分子诊断领域，具体地，涉及一种实时监测蒽环类化疗药血药浓度的时间分辨免疫检测试剂盒。
技术介绍
蒽环类药物(Anthracyclines)是一类常用的广谱抗肿瘤药物，主要包括多柔比星、表柔比星、吡柔比星、柔红霉素和米托蒽醌等，广泛地用于治疗血液系统恶性肿瘤和实体瘤，其中，多柔比星和表柔比星是乳腺癌辅助化疗方案的首选药物。但由于蒽环类药物普遍存在心肌毒性和肾毒性，初次使用蒽环类药物即可造成心脏损伤，随着药物累积剂量的增加毒性更明显且不可逆，严重的毒副作用和心肌毒性使其用药受限。为了更好发挥蒽环类药物的抗肿瘤作用，尽可能避免此药物不良反应对机体的损害，因此早期监测蒽环类药物引起的心脏毒性并及早干预显得尤为重要。另外，大多数抗肿瘤药物具有治疗指数低、毒性大的特点，体内吸收、分布、代谢、排泄过程存在广泛的差异；肿瘤病人中肝、肾损害常见，即使给予相同剂量的抗癌药物，血药浓度可相3～10倍；同时抗肿瘤药物作用存在滞后性。大多数药物的疗效与该药到作用部位的浓度或相关受体浓度密切相关，而药物在受体部位的浓度直接与血药浓度有关，两者呈现平行关系，因此，血药浓度的测定可作为间接衡量药物在作用部位或受体浓度的指标。而且，等同体重给药(mg/kg)或体表面积给药(mg/m2)下的稳态血药浓度在个体间存在显著差异，仅仅根据体表面积给药，大部分患者未能达到最优的药物暴露量。而基于的药物剂量选择，将稳态血药浓度维持在一定水平，能够使患者在疗效和毒性之间获得最佳平衡。因此，需要建立一套简便即时的血药监测方法来控制有效药物浓度。目前，蒽环类化疗药血药监测手段主要有紫外-高效液相色谱检测(UV-HPLC)、高效液相色谱法(HPLC)、和液质联用色谱(LC-MS/MS)以及利用蒽环结构自身荧光半定量的紫外分光光度法。色谱质谱定量所需血清样本量大，且检测前须对样本前处理，操作复杂繁琐，检测时间长，不符合即时监测及难以推广其应用。紫外分光光度法同样样品需求量大、灵敏度低、抗干扰能力差、专属性差，临床普及意义不大，已逐渐被淘汰。
技术实现思路
本专利技术为了克服现有技术的上述不足，提供一种实时监测蒽环类化疗药血药浓度的时间分辨免疫检测试剂盒。本专利技术需要对试剂盒所使用的原料进行制备与筛选，从而确定最佳原料，这一过程包括人工抗原的合成及偶联比的确定，多克隆抗体的制备，标记物和抗体的比例，包被抗体的浓度，标记物的稀释度，包被板的吸附性能和变异大小等。通过反复摸索和比对，确定了小分子人工抗原标记和纯化的最佳条件。为了实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案予以实现的。一种蒽环类化疗药血药浓度的时间分辨荧光检测试剂盒，包括校准品、校准品稀释液、铕标DOX-OVA抗原、抗DOX/EPI多抗、洗涤液、增强液、分析缓冲液、羊抗鼠IgG包被反应板。本专利技术发现使用DOX作为统一检测蒽环类化疗药的半抗原，能够将大多数的蒽环类化疗药都能检测出来，而如果用其他的蒽环类化疗药作为统一检测蒽环类化疗药的半抗原的话，能检出的蒽环类化疗药种类比较少，不具有普遍适用性。优选地，所述铕标DOX-OVA中DOX-OVA与Eu3+标记物的质量比为5:1，所述DOX-OVA中DOX与OVA的偶联质量比为12:1。优选地，所述抗DOX/EPI多抗制备使用的抗原为DOX-KLH，所述DOX-KLH中DOX与KLH偶联摩尔比为1:5。根据本专利技术一个优选的实施方案，上述校准品的制备步骤如下：用校准品稀释液，将DOX校准品配制成0、10、50、100、1000及2000ng/mL系列浓度的校准溶液，按每瓶1mL分装冻干，4℃保存备用。根据本专利技术一个优选的实施方案，校准品稀释液成分包括2mg/mlBSA及0.1％NaN3的50mM,pH7.8Tris-HCl缓冲液根据本专利技术一个优选的实施方案，包被反应板为按每孔0.5ug羊抗鼠IgG，100ul包被缓冲液加入96孔透明微孔板，并封闭冻干制备而成。其中封闭液成分为50mMTris-HCl，0.1％BSA、4％海藻糖、0.05％NaN3，pH7.2。根据本专利技术一个优选的实施方案，多柔比星人工合成抗原的制备是通过DOX上的氨基与经过EDC/NHS活化的载体蛋白(KLH/OVA)偶联并纯化得到，DOX与OVA的最佳偶联比为12:1。铕标记抗CEA抗体的制备步骤为：选用DOX-OVA作检测抗原进行Eu3+标记，抗原与Eu3+标记物的比例为5:1(质量比)为最佳比例。根据本专利技术一个优选的实施方案，抗DOX/EPI多抗以DOX-KLH偶联物作完全抗原免疫Balb/c小鼠制备得到，纯化后抗DOX/EPI多抗用磷酸盐缓冲液(0.1M,pH7.4)稀释浓度为1mg/ml，每瓶100ul分装，真空冷冻干燥。根据本专利技术一个优选的实施方案，分析缓冲液配方为：Tris-HCl(50Mm,pH7.8)、PEG6000(1.5％)、BSA(0.2％)、Proclin300(0.1％)、牛IgG(0.02％)、Tween20(0.1％)和NaCl(0.84％)。根据本专利技术一个优选的实施方案，洗涤液配方为：Tris-HCl(1.25mmol/L,pH7.8)、Tween20(2.5％)和NaCl(21％)。根据本专利技术一个优选的实施方案，增强液配方由β2二酮体、三辛基氧化磷(TOPO)、Triton200、醋酸和邻苯二甲酸氢钾(pH2.0～3.2)组成。根据本专利技术所述的抗DOX/EPI鼠源多克隆抗体的制备步骤如下：(1)DOX-KLH完全抗原的制备:将5mg血蓝蛋白(KLH)溶解于0.5ml磷酸盐缓冲液中(pH7.2,0.1M),分别配制10mg/mlEDC和NHS溶液，往KLH溶液中加入10ulEDC溶液和6.7ulNHS溶液，室温条件下活化30min。配制2mg/mlDOX水溶液，取1mg的DOX加入活化的KLH中，37℃避光反应过夜。反应后，用磷酸盐缓冲液(pH7.2,0.1M)透析24小时。抗原1mg分装冻干，-20℃贮存。DOX-OVA完全抗原的制备同上。(2)小鼠免疫:将DOX-KLH完全抗原，用1ml纯水溶解，免疫方式采用皮下多点注射免疫，每只Balb/c小鼠接种剂量为50μg，三周后同样用1ml纯水溶解DOX-KLH完全抗原冻干粉，对小鼠皮下多点注射，每只小鼠接种剂量为50μg，加强免疫2次。(3)血清效价测定：取小鼠尾静脉血，9000rpm，离心10min，将上清转入新的EP管中，对小鼠血清的效价测定采用时间分辨荧光免疫分析法，将DOX-OVA抗原溶于包被液中，配成5ug/ml包被液，每孔加入100μl，37℃振荡孵育1小时。弃液，拍干，加入封闭液，每孔200μl，4℃封闭过夜。次日，弃液，拍干。往包被好的反应孔内加入倍比稀释好的小鼠血清100μl/孔，并设阳性对照、阴性对照和空白对照，37℃孵育2小时。用洗涤液洗4次，加入用分析缓冲液以1:10000倍稀释铕标羊抗鼠IgG，100μl/孔，置37℃孵育1小时。用洗涤液洗6次，加入增强液，200μl/孔，37℃孵育5min，测值。(4)血清效价高于1/10000时，收集小鼠血清，分装，-20℃贮存。根据本专利技术所述的铕标记DOX-OVA合本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蒽环类化疗药血药浓度的时间分辨荧光检测试剂盒，其特征在于，包括校准品、校准品稀释液、铕标DOX‑OVA抗原、抗DOX/EPI多抗、洗涤液、增强液、分析缓冲液、羊抗鼠IgG包被反应板。

【技术特征摘要】
1.一种蒽环类化疗药血药浓度的时间分辨荧光检测试剂盒，其特征在于，包括校准品、校准品稀释液、铕标DOX-OVA抗原、抗DOX/EPI多抗、洗涤液、增强液、分析缓冲液、羊抗鼠IgG包被反应板。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述铕标DOX-OVA中DOX-OVA与Eu3+标记物的质量比为5:1，所述DOX-OVA中DOX与OVA的偶联质量比为12:1。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述所述抗DOX/EPI多抗制备使用的抗原为DOX-KLH，所述DOX-KLH中DOX与KLH偶联摩尔比为1:5。4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述DOX-OVA的制备方法为：将DOX溶于MES溶液中，加入EDC和NHS对其进行活化，活化后的DOX与溶于磷酸盐缓冲液的载体蛋白OVA偶联并纯化。5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述铕标DOX-OVA抗原...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴英松，刘天才，林冠峰，梁君瑜，
申请(专利权)人：南方医科大学，
类型：发明
国别省市：广东,44