一种测定样品中抗体浓度的方法技术

本发明专利技术公开了一种测定液体样品中的抗体浓度的方法，包括以下步骤：在反应室中将液体样品与抗体结合探针一起孵育以提供反应混合物，所述抗体结合探针包括与长寿命荧光染料缀合的通用抗体结合蛋白，测定反应室中的反应混合物的荧光偏振以检测激发光和发射光之间的偏振变化，并将偏振变化与样品的抗体浓度相关联。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】一种测定样品中抗体浓度的方法前言免疫荧光是一种用于使用荧光显微镜的光学显微技术的技术，并且主要用于微生物样品。该技术利用抗体对其抗原的特异性，使荧光染料靶向细胞内的特定生物分子靶标，因此通过样品使靶标分子的分布可视化。免疫荧光是广泛使用的免疫染色的实例，并且是利用荧光团使抗体的位置可视的免疫组织化学的具体实例。CN103642261、WO2013153687、JP2012224646、US2012296098、WO2012149180、EP2312317、US20110143387、JP2010037511和US4937198描述了荧光探针及其用途的实例。Nielsen等(Methods22，71-76，2000)、WO9613722、WO2009078876、EP0957365、WO2010141249和US2006105397描述了荧光偏振免疫测定法，并且其可用于快速、准确地检测抗体或抗原。该测定法是基于溶液中小分子的旋转比大分子更快以及旋转率可通过荧光偏振确定的原则。当样品中的抗体与标记有荧光探针的抗体的特异性抗原一起孵育时，可以通过荧光偏振检测样品中抗体-抗原复合物的存在。该技术的问题是，为了检测给定的抗体，需要该抗体的特异性抗原，这使得该测定对许多公司来说是昂贵的。该技术的另一个问题是不适合用于定量检测样品中的抗体。日本专利申请号2005-337805描述了一种使用荧光偏振测定抗体或抗原的方法，在一个实施方案中，使用重组通用(generic)抗体结合蛋白(蛋白A)和短寿命荧光染料(Alexa647)的缀合物定量测定人IgG。该日本文献描述了使用浓度为1nM或10nM的荧光标记蛋白A，其分别相当于0.00005或0.0005mg/ml。预期该蛋白A与抗体按1:1的比例结合，并且由于它们的分子量分别为50,000Da和150,000Da，这意味着按1:3的重量比结合。从而1mg的蛋白A将结合3mg的抗体，因此将是“饱和的”，所述“饱和的”意味着抗体浓度的任何增加不应导致偏振值的增加，因为不会发生更多的结合。因此，1nM和10nM的蛋白A将具有在0.000015mg/ml和0.00015mg/ml抗体浓度的IgG浓度下饱和(即不增加任何更多的特异性结合)的FP信号。这显然不会出现在该日本专利的附图中。唯一明显的增加发生在该饱和极限之后，其中偏振的任何变化不是由于蛋白A与抗体的特异性结合，而是由于人为效应，例如随着抗体浓度增加粘度增加。因此，该文献中呈现的数据表明，在实践中该专利技术不起作用。本专利技术的目的是克服上述问题中的至少一个。
技术实现思路
本专利技术是基于如下发现：可以使用荧光偏振和示踪剂来测定样品中的准确和灵敏的抗体浓度或滴度，所述示踪剂包括与通用免疫球蛋白结合蛋白(如蛋白A、蛋白G、蛋白A/G或蛋白L(以下称为“通用抗体结合蛋白”))缀合的长寿命荧光染料。这些蛋白质结合到所有免疫球蛋白G(IgG)分子的恒定区，并且因此可以用于测定任何IgG分子的浓度。图6显示了使用与短寿命染料相比的长寿命染料的影响。此外，本申请人已经出乎意料地发现，除去蛋白质的一部分(例如，除去了一个或多个抗体结合位点或非抗体结合位点)的截短通用抗体结合蛋白的使用提供了灵敏度的进一步提高。图7显示了使用与部分截短蛋白质(mw29KD)相比的高度截短IgG结合蛋白(mw7kD)的影响。在第一方面中，本专利技术提供了一种测定液体样品中抗体滴度的方法，包括以下步骤：将液体样品与抗体结合探针在反应室中一起孵育以提供反应混合物，所述抗体结合探针包括与荧光染料(通常为长寿命荧光染料)缀合的通用抗体结合蛋白；测定反应室中的反应混合物的荧光偏振，以检测激发光和发射光之间的偏振变化；和使偏振变化与所述样品的抗体滴度相关联。在使用长寿命荧光染料的实施方案中，优选地，所述长寿命荧光染料的荧光寿命为至少4ns。优选地，所述长寿命荧光染料的荧光寿命为至少5ns。优选地，所述长寿命荧光染料的荧光寿命为至少6ns。优选地，所述长寿命荧光染料的荧光寿命为至少7ns。优选地，所述长寿命荧光染料的荧光寿命为至少8ns。优选地，所述长寿命荧光染料的荧光寿命为至少9ns。优选地，所述长寿命荧光染料的荧光寿命为至少10ns。优选地，所述长寿命荧光染料的荧光寿命为至少15ns。优选地，所述长寿命荧光染料的荧光寿命为至少20ns。优选地，所述荧光染料是FITC。优选地，所述荧光染料选自FITC和寿命为至少5ns的长寿命荧光探针。优选地，所述通用抗体结合蛋白是蛋白A或蛋白。优选地，所述通用抗体结合蛋白是截短通用抗体结合蛋白。优选地，所述样品是细胞培养液。优选地，所述细胞是真核的或原核的生产细胞。优选地，所述反应室是多孔板的孔。优选地，所述通用抗体结合蛋白(即通用IgG结合蛋白)的分子量不大于15kD以及所述荧光染料的寿命为至少5ns(理想地为至少10或15ns)。更优选地，所述通用抗体结合蛋白(即通用IgG结合蛋白)的分子量不大于10kD以及所述荧光染料的寿命为至少5ns(理想地为至少10或15ns)。理想地，所述通用抗体结合蛋白(即通用IgG结合蛋白)的分子量不大于5kD以及所述荧光染料的寿命为至少5ns(理想地为至少10或15ns)。在第二方面中，本专利技术涉及测定多个细胞培养样本中抗体滴度的快速、高通量的方法，所述细胞培养样品包括抗体生产细胞(通常是IgG生产细胞，理想地是单克隆IgG生产细胞)，所述方法包括以下步骤：将微量滴定板的单个孔中的每个细胞培养样品与抗体结合探针一起孵育以提供多个反应混合物，所述抗体结合探针包括与长寿命荧光染料缀合的通用抗体结合蛋白(即通用IgG结合蛋白)；测定孔中的反应混合物的荧光偏振，以检测激发光和发射光之间的偏振变化；和使偏振变化与所述细胞培养样品的抗体滴度相关联。在一个实施方案中，所述多个细胞培养样品包括一组克隆生产细胞。因此，本专利技术还涉及测定一组克隆生产细胞中的抗体滴度的快速、高通量的方法。通常，该方法使用能够同时在微量滴定板的多个孔上进行荧光偏振测定的荧光偏振分析仪。本专利技术还提供了适于实施本专利技术方法的试剂盒，以及其包含(a)包含与荧光染料(优选长寿命荧光染料)缀合的通用抗体结合蛋白的抗体结合探针，和(b)荧光偏振分析仪。优选地，所述通用抗体结合蛋白是截短的。优选地，所述通用抗体结合蛋白是IgG结合蛋白。优选地，所述IgG结合蛋白是蛋白G。优选地，所述通用抗体结合蛋白包括分子量小于15kD或10kD的截短蛋白G。优选地，所述荧光染料是FITC或其荧光寿命为至少5ns。本专利技术还涉及一种荧光染料与通用抗体结合蛋白的缀合物。在一个实施方案中，所述通用抗体结合蛋白是截短的。在一个实施方案中，所述通用抗体结合蛋白的分子量小于30kD。在一个实施方案中，所述通用抗体结合蛋白的分子量小于25kD。在一个实施方案中，所述通用抗体结合蛋白的分子量小于20kD。在一个实施方案中，所述通用抗体结合蛋白的分子量小于15kD。在一个实施方案中，所述通用抗体结合蛋白的分子量小于10kD。在一个实施方案中，所述通用抗体结合蛋白的分子量小于8kD。在一个实施方案中，所述通用抗体结合蛋白的分子量小于5kD。在一个实施方案中，所述荧光染料是长寿命荧光染料。在一个实施方本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种测定液体样品中抗体浓度的方法，包括以下步骤︰在反应室中将液体样品与抗体结合探针一起孵育以提供反应混合物，所述抗体结合探针包括与荧光染料缀合的通用抗体结合蛋白；测定反应室中的反应混合物的荧光偏振以检测激发光和发射光之间的偏振变化；和使偏振变化与样品的抗体滴度相关联，其特征在于，所述荧光染料是长寿命荧光染料，以及其中所述通用抗体结合蛋白是截短的。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.07.15 EP 14177005.71.一种测定液体样品中抗体浓度的方法，包括以下步骤︰在反应室中将液体样品与抗体结合探针一起孵育以提供反应混合物，所述抗体结合探针包括与荧光染料缀合的通用抗体结合蛋白；测定反应室中的反应混合物的荧光偏振以检测激发光和发射光之间的偏振变化；和使偏振变化与样品的抗体滴度相关联，其特征在于，所述荧光染料是长寿命荧光染料，以及其中所述通用抗体结合蛋白是截短的。2.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述长寿命荧光染料的寿命为至少5ns。3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述长寿命荧光染料是FITC或其寿命为至少5ns。4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述通用抗体结合蛋白是蛋白G或蛋白A。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述通用抗体结合蛋白是截短蛋白G或截短蛋白A。6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述截短蛋白G的分子量小于20kD。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述截短蛋白G的分子量小于15kD。8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述截短蛋白G的分子量小于10kD。9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述截短蛋白A的分子量小于50kD。10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述截短蛋白A的分子量小于40kD。11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述截短蛋白A的分子量小于30kD。12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述截短蛋白A的分子量小于20kD。13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述截短蛋白A的分子量小于10kD。14.根据权利要求1所述的方法，其中所述荧光染料是FITC或寿命为至少5ns的荧光染料，以及其中所述通用抗体结合蛋白是截短蛋白G或截短蛋白A。15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：B·汤普森，D·詹姆斯，J·克利福德，
申请(专利权)人：瓦里泰细胞有限公司，
类型：发明
国别省市：爱尔兰,IE