本发明专利技术提供一种高亲和力的人白细胞介素-6受体(hIL6R)鼠单克隆抗体，抗体能特异性识别重组hIL6R蛋白，有效阻断重组hIL6R和重组IL6的结合。基于该抗体建立了高灵敏度的双抗夹心酶联免疫检测方法，可用于IL6R的特异性检测。抗体可特异性识别细胞膜上的hIL6R，能有效阻断细胞上hIL6R与IL6的结合介导的细胞增殖抑制效应。所述抗体为进一步开发临床治疗性药物提供了候选抗体。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医学
，涉及一种人白介素6受体(hIL6R)的高亲和力中和活性抗体的制备及其应用。
技术介绍
人白细胞介素-6 (human interleukin-6, hIL6)是一种具有多重免疫调节功能的细胞因子，具有广泛的生物学功能，可由T淋巴细胞、B淋巴细胞、成纤维细胞、内皮细胞、巨噬细胞和心肌细胞等产生。hIL6通过细胞上的两种蛋白传导其生物活性，一种是人白细胞介素 _6 受体(human interleukin-6 receptor, hIL6R)，一种是分子为 130KD 的 gpl30 蛋白。hIL6和hIL6R结合形成二元复合物，此复合物再与细胞膜结合的gpl30相互作用，然后诱导信号传导。hIL6R 可分为细胞膜结合型和可溶性 hIL6R(human soluble interleukin-6receptor, hsIL6R)两种类型。细胞膜结合型hIL6R由468个氨基酸组成，切除N端19个氨基酸的信号肽后获得含有449个氨基酸的成熟分子，有6个N-糖基化位点，分子量为80KD，分为胞外区、穿膜区和包浆区，三个区分别包含339、28和82个氨基酸。hIL6R即与hIL6的结合，又与gpl30蛋白的偶联，单独的hIL6R和hIL6结合是低亲和力。hIL6R分布较广，分布于淋巴细胞和非淋巴细胞，如活化B细胞，骨髓瘤细胞，静止T细胞、肝细胞和单核细胞等。hIL6R在很多肿瘤细胞上也都有表达，如多发性骨髓瘤、前列腺癌、白血病等。对hIL6R在疾病组织中的表达情况的检测可以对相关疾病的情况进行评价或跟踪。hsIL6R是hIL6R的一种特殊形式，分子量为50KD，与细胞膜结合型的hIL6R的胞外区的只有C端的10个氨基酸不同。hsIL6R可以和hIL6结合，形成的hsIL6R/hIL6复合体和细胞膜上的gpl30结合从而 也可以诱导胞内信号传导。通过这种机制，hIL6可以激活不表达hIL6R的细胞，所以hsIL6R在hIL6的信号传导中扮演着重要的角色。研究发现报道称在一些慢性炎症性疾病和自身免疫性疾病中出现hsIL6R的高水平表达；另外恶性肿瘤患者血清中hsIL6R水平明显高于健康对照组，随着病情的加重hsIL6R水平进一步升高，表明对血清中的hsIL6R的检测对恶性肿瘤病情的监察及治疗效果的判断可能有一定的参考价值。目前研究表明hIL6与多种疾病如炎症性疾病、自身免疫性疾病及肿瘤的发生、发展和预后有关，某些急性炎症、自身免疫性疾病及淋巴细胞恶性肿瘤等疾病均与体内hIL6水平异常增高相关。hIL6只能通过其受体来进行作用，对hIL6表达的调节可以在其受体水平上进行，所以hIL6R成为多种疾病的治疗靶点，为药物筛选和药物设计提供了新的思路和方法。可通过hIL6R抗体阻断hIL6R和hIL6的结合，从而可能达到治疗hIL6相关疾病的目的，比如类风湿性关节炎、Castleman氏症、系统性红斑狼疮(SLE)、银屑病及2岁及肿瘤等。类风湿性关节炎的发病率为总人口的0. 8%，且80%的患者在35-50岁发病，对患者和社会都带来很大的痛苦和负担。Castleman氏症的发病率尚无明确统计，但它可发生在存在淋巴结的任何部位，常见于年轻人，可在任何年龄发病。银屑病发病率占世界人口的0. 1% 3%，给患者的身心都带来了很大的创伤。hIL6R的抗体是有巨大的前景的治疗这些疾病的药物靶标。目前应用于临床的hIL6R的抗体只有tocilizumab。Tocilizumab被美国食品药品管理局(FDA)批准用于治疗类风湿性关节炎，适用于使用其他已获批的治疗药物无效的成年中重度类风湿性关节炎患者。Tocilizumab被日本批准用于Castleman氏症的治疗。Tocilizumab在其他疾病，如银屑病和系统性红斑狼疮(SLE)等也表现出了一定的治疗效果，表现出更大的市场潜力和市场需求。但是目前市场上只有一家公司有hIL6R抗体药物，全球市场的空缺很大。而我国目前还没有上市的相关产品，所以迫切需要研发hIL6R的抗体药物，弥补国内的空白。该专利技术提供的hIL6R高亲和力鼠单克隆抗体的成功研制恰为相关药物的研发提供了优质的候选抗体，也将为进一步研制其他类型抗体(如人源化抗体)提供了条件和基础。
技术实现思路
本专利技术提供一种hIL6R高亲和力鼠单克隆抗体，该抗体能与重组表达的hIL6R结合，也能与细胞水平的hIL6R结合。该抗体与重组hIL6R结合的亲和常数为1. 72X10_nM。该抗体的轻链氨基酸序列为SEQ ID NO 1 ;重链氨基酸序列为SEQ ID NO 2 ;轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO :3，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO 4 ;轻链上互补决定区⑶R1，CDR2，CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO :5，SEQ ID NO :6，SEQ ID NO 7 ;重链上互补决定区 CDRl, CDR2, CDR3 的氨基酸序列分别为 SEQ ID NO :8，SEQ ID NO :9，SEQ ID NO :10。本专利技术用来制备hIL6R鼠单克隆抗体的免疫原是利用哺乳动物细胞在体外重组表达的hIL6R胞外区片段，采用的技术是小鼠杂交瘤技术。 本专利技术利用酶联免疫检测方法，证明所述hIL6R单克隆抗体可以在蛋白水平有效的阻断重组hIL6R和重组hIL6的结合，说明该抗体在蛋白水平上具有中和活性。另外，本专利技术利用细胞活性检测试验，证明所述hIL6R鼠单克隆抗体可以有效阻断hIL6与hIL6R结合介导的抑制细胞增殖的效应，说明该抗体在细胞水平上具有中和活性。具有中和活性的抗hIL6R单克隆抗体将成为进一步开发临床治疗性药物的候选抗体。中和活性检测实验以半数有效浓度(concentration for 50% of maximum effect,EC50)作为抗体中和能力的判断依据。本专利技术还提供一种基于所述hIL6R鼠单克隆抗体建立的hIL6R酶联免疫检测方法(ELISA)。该ELISA使用的是双抗夹心酶联免疫检测方法，捕获抗体为本专利技术的hIL6R鼠单克隆抗体,检测抗体为hIL6R多克隆抗体，标准样品为体外重组表达的hIL6R。检测的灵敏度为0. 031ng/ml，所建立的ELISA方法可用于hIL6R的特异性检测。附图说明图1 hIL6R鼠单克隆抗体亲和力测定图2 hIL6R鼠单克隆抗体在蛋白水平上的中和活性的检测图3 hIL6R鼠单克隆抗体在细胞水平上的中和活性的检测图4基于抗hIL6R鼠单克隆抗体建立的酶联免疫检测方法的标准曲线具体实施例方式实施例1、hIL6R鼠单克隆抗体的制备l、hIL6R鼠单克隆抗体的制备I)动物免疫为了获得可以识别hIL6R蛋白的鼠单克隆抗体，该专利技术以北京义翘神州生物技术有限公司生产的重组hIL6R胞外区片段为免疫原，免疫Balb/c小鼠，每只小鼠免疫50 ii g，首次免疫将免疫原与等量的完全弗氏佐剂制成乳化剂，腹部皮下多点注射，间隔3周取相同剂量免疫原与等量不完全弗氏佐剂制成乳化剂，加强免疫两次，三次免疫后测定血清效价，取血清效价高的小鼠用免疫原腹腔加强免疫一次，3天后取脾进行融合。2)细胞融合和克隆化取小鼠脾细胞，按5-10 I比例与本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种高亲和力的人白细胞介素?6受体(human?interleukin?6?receptor，hIL6R)抗体，其特征在于：轻链上互补决定区CDR1，CDR2，CDR3的氨基酸序列分别为SEQ?ID?NO：5，SEQ?ID?NO：6，SEQ?ID?NO：7；重链上互补决定区CDR1，CDR2，CDR3的氨基酸序列分别为SEQ?ID?NO：8，SEQ?ID?NO：9，SEQ?ID?NO：10。
【技术特征摘要】
1.一种高亲和力的人白细胞介素-6受体(human interleukin-6 receptor, hIL6R)抗体，其特征在于轻链上互补决定区⑶R1，⑶R2，⑶R3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO :5，SEQ ID NO 6,SEQ ID NO :7 ;重链上互补决定区CDR1，CDR2，CDR3的氨基酸序列分别为SEQID NO :8，SEQ ID NO :9，SEQ ID NO :10。2.权利要求1所述的抗体，其轻链可变区氨基酸序列为SEQID NO :3，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO :4。3.权利要求1所述的抗体，其轻链氨基酸序列为SEQID NO:1 ;重链氨基酸序列为SEQID NO :2。4.权利要求1所述的抗体为单克隆抗体。5.权利要求4所述的抗体，其特征为轻链...
【专利技术属性】
技术研发人员：谢良志，张杰，赵静，孙春昀，贺正颖，胡萍，王加兰，李莉，
申请(专利权)人：神州细胞工程有限公司，
类型：发明
国别省市：
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