本发明专利技术公开了在线微透析采样‑流动注射化学发光联用分析法在针对小分子半抗原的单克隆抗体的亲和力测定中的应用及其具体测定方法，该联用分析法是在非标记的条件下于均相体系中研究小分子半抗原与单克隆抗体间的亲和力，方法简单、便捷、稳定、灵敏。与现有的测定抗体亲和力的方法相比，其无需用酶等信号分子对抗体进行标记，也无需将小分子半抗原与载体蛋白偶联后用于包被，可以省去标记、偶联等繁琐工作，更重要的是可以更加客观的反映抗原与抗体间的真实结合情况，且不需要昂贵的仪器，成本较低。本发明专利技术不仅为抗体的性能评价提供了一种简单、快速、客观的分析技术手段，同时也是对微透析采样技术应用领域的新拓展。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于免疫分析领域，涉及在线微透析采样-流动注射化学发光联用分析法在针对小分子半抗原的单克隆抗体的亲和力测定中的应用。
技术介绍
单克隆抗体技术是一种免疫学技术，它将产生抗体的单个B淋巴细胞同肿瘤细胞杂交，获得既能产生抗体、又能无限增殖的杂交瘤细胞，并以此生产抗体。该技术为抗体的分子学研究提供了一个全新的手段，极大地促进了免疫学的发展。近年来，单克隆抗体技术在免疫检测、免疫治疗、分离纯化等领域得到了非常广泛的应用。在单克隆抗体的制备和筛选过程中，最重要的工作之一是对不同细胞株分泌的单克隆抗体对特定抗原的结合亲和力这一关键指标进行评价，其对于单克隆抗体的开发应用具有十分重要的指导意义。目前，用于测定抗原-抗体间结合常数的方法主要包括竞争结合法、硫氰酸盐洗脱法、非竞争酶免疫分析法等基于抗体标记的异相分析方法。近年来，也有一些非标记的方法用于测定抗体亲和力，其原理与前述标记法类似，不同之处在于抗体无需以信号探针标记，而是在抗原和抗体结合后，以表面等离子体共振、石英晶体微天平等非标记方法测定传感器界面上的生物结合反应，依此研究抗原和抗体的结合过程。标记法的弊端在于，所有抗体均需要以酶等信号分子进行标记，一来标记过程繁琐，二来标记可能影响抗体的生物活性，所获得的测定结果难以客观反映抗原-抗体间真实的亲和力。而无论是标记法还是非标记法，都需要将抗原固定于酶标板或传感器表面。如果抗原是小分子半抗原，由于它们很难在酶标板或传感器表面有效固定，通常需要与载体蛋白偶联形成人工完全抗原后方可用于包被，而偶联可能带来以下问题：首先，偶联过程较为麻烦；其次，偶联可能破坏抗原分子结构中的抗原决定簇，或者，抗原决定簇与偶联蛋白距离过近，对抗原-抗体间的结合反应产生空间位阻，均不能真实反映抗体的亲和力。因此，有必要发展一种无需对小分子半抗原及抗体进行偶联或标记即可直接进行针对小分子半抗原的单克隆抗体亲和力测定的均相分析方法。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种无需对小分子半抗原及抗体进行偶联或标记即可直接进行针对小分子半抗原的单克隆抗体亲和力测定的均相分析方法。为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：1．在线微透析采样-流动注射化学发光联用法在小分子半抗原与单克隆抗体间亲和力测定中的应用。2. 在线微透析采样-流动注射化学发光联用法测定小分子半抗原与单克隆抗体间亲和力的方法，包括以下步骤：在小分子半抗原与单克隆抗体的均相免疫反应体系中，采用在线微透析采样方法获得含有部分游离小分子半抗原的透析液，再采用流动注射化学发光法测定透析液中游离小分子半抗原的浓度，结合微透析采样方法的透过率求得均相免疫反应体系中游离小分子半抗原的浓度，进一步计算出均相免疫反应体系中与单克隆抗体结合的小分子半抗原的浓度，最后根据Scatchard分析或/和Klotz分析计算出单克隆抗体的亲和力常数。优选的，所述方法具体包括以下步骤：（1）制备一系列已知不同浓度的小分子半抗原溶液，采用流动注射化学发光法分别测定其化学发光强度，以化学发光强度对小分子半抗原的浓度作图得工作曲线；（2）将已知浓度的小分子半抗原溶液采用在线微透析采样方法获得含有部分小分子半抗原的透析液，采用流动注射化学发光法测定透析液的化学发光强度，根据步骤（1）所得工作曲线推算出透析液中小分子半抗原的浓度，进一步计算出微透析采样方法的透过率；（3）固定单克隆抗体的浓度，将其分别与一系列已知不同浓度的小分子半抗原进行结合反应，得到一系列均相免疫反应体系，采用在线微透析采样方法分别获得一系列含有部分游离小分子半抗原的透析液，采用流动注射化学发光法分别测定该系列透析液的化学发光强度，根据步骤（1）所得工作曲线分别推算出该系列透析液中游离小分子半抗原的浓度，结合步骤（2）所得微透析采样方法的透过率求得该系列均相免疫反应体系中游离小分子半抗原的浓度，进一步计算出该系列均相免疫反应体系中与单克隆抗体结合的小分子半抗原的浓度，最后根据Scatchard分析或/和Klotz分析计算出单克隆抗体的亲和力常数。作为一个具体实例，所述单克隆抗体为特布他林单克隆抗体，小分子半抗原为特布他林。作为上述实例的一个优选实施方式，在线微透析采样-流动注射化学发光联用法测定小分子半抗原与单克隆抗体间亲和力的方法具体为：步骤（1）和（2）中所述小分子半抗原溶液和步骤（3）中所述均相免疫反应体系的溶剂均为0.010 M pH 7.4 PBS缓冲液；步骤（1）至（3）中所述流动注射化学发光法具体如下：发光剂为1.0×10-5 M 鲁米诺和1.0×10-4M 铁氰化钾，所述浓度的鲁米诺由1.0×10-2 M氢氧化钠溶解制得；载流和发光剂的流速均为2.2 mL/min；步骤（2）和（3）中所述在线微透析采样方法具体如下：采样温度为37 ℃；灌流液为0.010 M pH 7.4 PBS缓冲液，灌流速度为4.0 μL/min。本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供了在线微透析采样-流动注射化学发光联用分析法在针对小分子半抗原的单克隆抗体的亲和力测定中的应用及其具体测定方法，该联用分析法是在非标记的条件下于均相体系中研究小分子半抗原与单克隆抗体间的亲和力，方法简单、便捷、稳定、灵敏。与传统的标记型方法相比，其无需用酶等信号分子对抗体进行标记，可以省去标记这一繁琐工作，可以更加客观的反映抗原与抗体间的真实结合情况。与非标记方法相比，其无需将小分子半抗原与载体蛋白偶联后用于包被，可以省去偶联这一繁琐工作，真实反映抗体的亲和力，而且不需要昂贵的仪器，成本较低。本专利技术不仅为抗体的性能评价提供了一种简单、快速、客观的分析技术手段，同时也是对微透析采样技术应用领域的新拓展。附图说明图1为在线微透析采样-流动注射化学发光联用分析装置（MP：微量注射泵；M：微透析探针；P1：载流传输装置；P2：发光剂传输装置；V：进样阀；F：流通池；D：化学发光检测器；W：废液；a：载流；b：发光剂1；c：发光剂2；Anti-TEB：特布他林单克隆抗体；Terbutaline：特布他林；PBS：PBS缓冲液）。图2为流动注射化学发光法检测硫酸特布他林的工作曲线。图3为特布他林与其单克隆抗体相互作用的Scatchard曲线。图4为特布他林与其单克隆抗体相互作用的Klotz曲线。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本专利技术的优选实施例进行详细的描述。图1为在线微透析采样-流动注射化学发光联用分析装置。如图所示，该分析装置包括微透析采样系统和流动注射化学发光系统；所述微透析采样系统包括微量注射泵和微透析探针；所述流动注射化学发光系统包括载流传输装置、发光剂传输装置、进样阀、流通池和化学发光检测器；所述微透析探针的液体出口与流动注射化学发光系统中的进样阀连通。该分析装置由计算机进行程序自动化控制。采用上述分析装置进行小分子半抗原与单克隆抗体间亲和力测定时，先将小分子半抗原和单克隆抗体的均相免疫反应体系进行一定时间的温育，使免疫反应达到平衡，再将微透析探针置于达到平衡的免疫反应体系中，利用微量注射泵将灌流液推送至微透析探针处，使灌流液经微透析探针与免疫反应体系进行透析交换，交换后的透析液（含游离小分子半抗原）进入进样阀的采样环本文档来自技高网...
【技术保护点】
在线微透析采样‑流动注射化学发光联用法在小分子半抗原与单克隆抗体间亲和力测定中的应用。
【技术特征摘要】
1.在线微透析采样-流动注射化学发光联用法在小分子半抗原与单克隆抗体间亲和力测定中的应用。2.在线微透析采样-流动注射化学发光联用法测定小分子半抗原与单克隆抗体间亲和力的方法，其特征在于，包括以下步骤：在小分子半抗原与单克隆抗体的均相免疫反应体系中，采用在线微透析采样方法获得含有部分游离小分子半抗原的透析液，再采用流动注射化学发光法测定透析液中游离小分子半抗原的浓度，结合微透析采样方法的透过率求得均相免疫反应体系中游离小分子半抗原的浓度，进一步计算出均相免疫反应体系中与单克隆抗体结合的小分子半抗原的浓度，最后根据Scatchard分析或/和Klotz分析计算出单克隆抗体的亲和力常数。3.根据权利要求2所述的在线微透析采样-流动注射化学发光联用法测定小分子半抗原与单克隆抗体间亲和力的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：（1）制备一系列已知不同浓度的小分子半抗原溶液，采用流动注射化学发光法分别测定其化学发光强度，以化学发光强度对小分子半抗原的浓度作图得工作曲线；（2）将已知浓度的小分子半抗原溶液采用在线微透析采样方法获得含有部分小分子半抗原的透析液，采用流动注射化学发光法测定透析液的化学发光强度，根据步骤（1）所得工作曲线推算出透析液中小分子半抗原的浓度，进一步计算出微透析采样方法的透过率；（3）固定单克隆抗体的浓度，将其分别与一系列已知不同浓度的小分子半抗原进行结合反应，得到一系列均相免疫反应体系，采用在线微透析采样方...
【专利技术属性】
技术研发人员：付志锋，王平石，周娅莉，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆;50
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