用于生产高亲和力抗体的方式和方法技术

本发明专利技术提供了用于使用稳定的B细胞培养物产生抗目标抗原的高亲和力抗体的方式和方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本专利技术提供了用于使用稳定的B细胞培养物产生抗目标抗原的高亲和力抗体的方式和方法。【专利说明】
本专利技术涉及细胞生物学领域。更具体地，本专利技术涉及抗体生产领域。
技术介绍
体外B细胞培养是当前生物学和医学应用中的重要工具。一个重要应用是培养产生抗体的细胞以获得抗体，优选获得单克隆抗体。单克隆抗体(HiAb)代表单个抗体分子的多个相同拷贝。其中HiAb的益处是它们对抗原上的相同表位的特异性。该特异性赋予HlAb比更传统的治疗好的某些临床优势，同时为患者提供了一种有效、耐受良好且通常具有低副作用的治疗选择。另外，mAb可用于生物学和医学研究。在模拟生发中心(GC)反应的一些关键方面的条件下(即使用CD40配体(L)激活B细胞，和在细胞因子如白介素(IL)-4、IL-10或IL-21的存在下)可以体外培养成熟的B细胞。同时用⑶40L、IL-2和IL-4培养的B细胞产生非常少量的Ig，添加IL-21导致B细胞分化为浆细胞，且伴随高Ig的分泌。虽然已经证明该体外系统可用于研究B细胞分化的一些方面，但初始IgD+的B细胞和切换的(switched) IgD-记忆B细胞最终分化为末端分化的衆细胞(terminally differentiated plasma cell),该末端分化的衆细胞伴随着妨碍长期抗原特异性的BCR阳性细胞系的产生的细胞周期阻滞(cell cycle arrest) 0最近的进展已经深入了解了多个转录因子(包括B淋巴细胞诱导的成熟蛋白I(BLIMPl)和B细胞淋巴瘤因子(BCL) 6 )如何控制GC B细胞发育成终末阻滞的产生抗体的浆细胞。研究显示出转录阻遏蛋白BCL6阻止浆细胞分化。BCL6在GC B细胞中高度表达，在该GC B细胞中BCL6通过下调p53促进B细胞扩张，且通过负调节BUMP1阻止GC细胞过早分化为衆细胞。最近，在W02007/067046中描述了一种用于生成产生抗体的成浆细胞样B细胞的改进方法，据此通过引用将W02007/067046并入本文。根据该方法，在B细胞(优选记忆B细胞)中调节BCL6和Bcl-2家族成员(优选Bcl-xL)的量以生成产生抗体的成浆细胞样B细胞。在W02007/067046中，直接或间接地影响BCL6和/或Bcl-xL表达产物的量。优选地，因为BCL6和Bcl-xL表达产物均参与产生抗体的B细胞的稳定，因此该两种表达产物的量在所述产生抗体的细胞中升高。所述Bcl-xL是抗凋亡Bcl-2家族的成员。由Bcl-2家族控制的过程涉及凋亡的线粒体途径，其中Bcl-2家族包括促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白。当隔绝在线粒体外膜和内膜之间的分子通过线粒体外膜透化被释放至细胞质中时，该途径推进。促凋亡家族成员可以被分为两类。效应因子Bax和Bak通过形成蛋白脂质孔来参与透化线粒体外膜，其中效应因子Bax和Bak包含所谓的Bcl-2同源结构域3(BH3)的结构域；促凋亡的唯 BH3 域蛋白(Bad、Bik、Bim、Bid、Hrk、Bmf、bNIP3、Puma 和 Noxa)通过与其他(抗凋亡)Bcl-2家族成员的蛋白-蛋白相互作用而作用于不同的细胞应激。抗凋亡的Bcl-2家族成员Bcl-2、Bcl-xL, Bcl_w、Al和Mcl-1通常与线粒体外膜整合。他们直接结合且抑制促凋亡的Bcl-2蛋白以保护线粒体膜的完整。在所述方法中，进一步优选地是所述产生抗体的成浆细胞样B细胞用IL21和CD40L培养。优选地，在CD40L的存在下培养B细胞(诸如产生抗体的成浆细胞样B细胞)，因为CD40L有助于大部分B细胞的复制。进一步优选地，在所述产生抗体的B细胞中激活STAT3。可以通过多种方式实现STAT3的激活。优选地，通过向产生抗体的细胞提供细胞因子来激活STAT3。天然参与B细胞分化的细胞因子对调节STAT3蛋白是非常有效的。STAT3的非常有效的激活因子是IL 2、IL 10、IL 21和IL 6，但是已知IL 7、IL 9、IL 15、IL 23和IL 27也能够激活STAT3。另外或可选择地，通过将编码STAT3突变体的核酸转移至B细胞中实现STAT3的激活，其中该STAT3突变体赋予STAT3的组成性激活(Sean A Diehl7HeikeSchmidlin, Maho Nagasawa, Simon D van Haren, Mark J Kwakkenbos, Etsuko Yasuda,Tim Beaumont, Ferenc A Scheeren, Hergen Spits STAT3_mediated up-regulation ofBLIMPl is coordinated with BCL6 down-regulation to control human plasma celldifferentiation J Tmmunol 2008 vol.180 (7)pp.4805-15)。最优选的是使用IL 21，因为IL 21特别适用于影响产生抗体的成浆细胞样B细胞的稳定。除了上调STAT3之外，IL 21即使在Blimpl的表达被BCL6抵消时仍然能够上调Blimpl的表达。通过在WO 2007/067046中公开的方法，延长产生抗体的细胞的复制寿命成为可能，因为可以将B细胞保持在发生复制的发育阶段。在早期体外B细胞培养中，复制寿命仅有几个星期至两个月。在这段时间内，培养的细胞丧生了他们的复制能力而死亡。但是通过如在WO 2·007/067046中公开的方法，延长产生抗体的记忆B细胞的复制寿命成为可能，以便发生包括能够复制且产生抗体的成浆细胞样B细胞的体外培养。虽然这些方法能够产生有效祀定目标抗原(antigen of interest)的抗体,但是经常想获得抗体特性(诸如结合亲和力)的改善。因此通常通过在编码的核酸(encodingnucleic acid)(优选在⑶R编码区)中引入突变且检验所产生的抗体来改变结合特性。但是该方法耗费时间。因此想得到用于获得高亲和力抗体的替代方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供用于产生和/或选择高亲和力抗体的方法。本专利技术提供了用于从给定的B细胞培养物起始以获得B细胞群的方式和方法，该B细胞群比最初的B细胞培养物具有更高的平均结合能力。优选地，从单克隆B细胞培养物产生单克隆B细胞群。本专利技术提供了一种简单精确的方法，用于获得具有增强的平均结合能力的B细胞群，且不需要辛苦的突变技术。本专利技术提供了一种用于产生对目标抗原特异性的抗体的方法，所述方法包括:a)选择能够产生对所述目标抗原特异性的抗体的B细胞,或者选择B细胞,该B细胞能够分化成能产生对所述目标抗原特异性的抗体的B细胞；b)诱导、增强和/或保持所述B细胞中的BCL6的表达；c)诱导、增强和/或保持所述B细胞中的抗凋亡核酸的表达；d)允许所述B细胞扩张(expansion)成为所述B细胞的群；e)从所述B细胞的群中选择至少一个B细胞，所述至少一个B细胞产生对所述目标抗原具有比所述B细胞的群的平均结合能力高的结合能力的B细胞受体和/或抗体；f)将所述至少一个B细胞培养成为B细胞的群；以及g)获得由所述B细胞的培养物产生的抗体。在能够产生对目标本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：T·博蒙特，M·J·克瓦肯博斯，H·斯皮茨，阿德里亚努斯·桂里努斯·巴克尔，科恩·瓦格纳，
申请(专利权)人：埃姆医疗有限公司，
类型：
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