本发明专利技术提供用于制备合理设计的亲和力降低的新抗体的方法。本发明专利技术的方法制备这样的抗体，其具有设计成在不改变总体三维抗体结构的情况下降低或消除亲代抗体的抗原结合活性的可变结构域。使用在不同测定法中采用本发明专利技术方法制备的抗体允许研究人员将特异性抗原-抗体相互作用产生的作用与其它非特异性抗体作用区分。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉引用 本申请要求2010年I月28日提交的美国临时申请61/299，162的权益的优先权，其整个内容通过引用结合到本文中。
技术介绍
单克隆抗体因其以高度特异性结合抗原的能力而被广泛用作研究、诊断和治疗试剂。除其与抗原特异性结合外，单克隆抗体还可以通过其Fe区活化补体系统和效应细胞。为了正确地说明抗体的生物学性质，合适的对照是必需的。在没有合适对照的情况下，难以确定抗体的特异性结合活性与抗体的生物化学和生物学作用之间的因果关系。目前使用的对照单克隆抗体包括1.由天然存在的浆细胞瘤分泌的无已知靶抗 原的抗体；2.针对来自进化远缘物种例如KLH (匙孔戚血蓝蛋白)的抗原产生的抗体；3.与不同于目的抗原的已知靶抗原起反应的抗体。在这些情况的每一种中，所用对照抗体具有限定不清的可变结构域和不确定的抗原特异性。而在第三种情况下，仍存在交叉反应性的问题。因此，当使用目前可获得的对照抗体时，常常会遇到例如交叉反应性或非特异性结合等问题。此外，由于缺乏理想的对照抗体，因此常常使用制剂溶媒(例如生理盐水)作为对照进行研究。在这种情况下，如果不是不可能的话，也难以区别所观察到的生物化学和/或生物学作用是特异性抗原/抗体相互作用的直接结果，还是非特异性作用的结果，非特异性作用例如抗体分子的其它部分或存在于抗体制备物中的污染物(例如宿主细胞蛋白质)的相互作用和生物学作用。鉴于至少这些原因，目前极其需要改进的合理设计的对照抗体。专利技术概述 一方面，本专利技术提供用于产生结合能力降低的互补决定区(CDR)的方法，所述方法包括以下步骤(a)从CDR多肽内鉴定出能够与抗原相互作用的至少一个结合氨基酸；和(b)改变CDR多肽内的所述至少一个结合氨基酸，使得所得CDR在结合抗原方面的能力降低。在一些实施方案中，所述⑶R位于抗体或抗体片段内。在一些实施方案中，所述方法还包括验证抗原结合丧失的步骤。可通过FACS分析实现验证步骤。另一方面，本专利技术提供用于产生结合能力降低的抗体或抗体片段的方法，所述方法包括以下步骤(a)自抗体或抗体片段内鉴定出能够与抗原相互作用的至少一个结合氨基酸；和(b)改变抗体或抗体片段内的所述至少一个结合氨基酸，使得所得抗体在结合抗原方面的能力降低。在一些实施方案中，所述方法还包括验证抗原结合丧失的步骤。可通过FACS分析实现验证步骤。在一些实施方案中，所述相互作用是氢键、盐桥和/或范德华力。在某些实施方案中，所述结合氨基酸是天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、组氨酸或谷氨酰胺。在其它实施方案中，所述结合氨基酸是酪氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、色氨酸、精氨酸、苯丙氨酸或甘氨酸。在一些实施方案中，所述结合氨基酸被非结合氨基酸替换。在一些实施方案中，所述非结合氨基酸是丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸或甲硫氨酸。在本专利技术的某些实施方案中，通过分析描述CDR和抗原间的复合物的晶体结构来进行鉴定结合氨基酸的步骤。另一方面，本专利技术包括采用本专利技术的方法产生的抗体或抗体片段。在一些实施方案中，本专利技术的抗体或抗体片段具有大于或等于约10_7的解离常数(Kd)。在一些实施方案中，本专利技术的抗体或抗体片段是完整的免疫球蛋白分子、scFv, Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2、Fd片段、Fv或二硫键连接的Fv。附图简述 图I表示描述制备本专利技术的对照抗体的流程图。图2表示参与抗体-抗原相互作用的特定⑶R氨基酸的频率。图3表示包括Fv结构域、Fab结构域和Fe结构域的抗体结构的示例性示意图。 图4表示重组抗体生产的示例性方法的图示。图5表不OKT3的抗体产生和本专利技术的一些不例性对照抗体。图6表示表明本专利技术的一些示例性对照抗体与人Jurkat细胞结合的FACS图。图7表示表明本专利技术的一些示例性对照抗体与人PBMC结合的FACS图。图8表示编码0KT3重链的pME-wt0KT3 HC载体的图谱。图9表示编码0KT3轻链的pME-wt0KT3 LC载体的图谱。附图说明图10表示0KT3和0KT3变体与Jurkat细胞的结合。图11表示变体抗体的药代动力学。专利技术详述 本专利技术提供亲和力降低的新抗体，其具有在基本不改变抗体的三维结构的情况下降低或消除抗原结合的充分表征的可变结构域。为了更容易地理解本专利技术，下文以及整个说明书对某些术语和短语作出定义。术语“抗体”在生物学和生物医学领域中被充分理解，通常是指完整抗体及任何抗体片段或其单链。抗体是由称为浆细胞的特化B淋巴细胞分泌的糖蛋白。其亦被称为免疫球蛋白(Ig)，因为其含有存在于许多蛋白质中的共有结构域。抗体最可能包含通常由二硫键连接的2条重(H)链和2条轻(L)链或其抗原结合部分。每条重链由重链可变区(Vh)和重链恒定区组成。每条轻链同样由可变区(')和恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。V1^P'区可进一步再分成超变区，称为互补决定区(CDR)，其散布有称为构架区(FR)的更保守的区域。每个￥11和'由按以下顺序自氨基端到羧基端排列的3个CDR和4个FR组成FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。本专利技术还包括抗体片段。抗体片段的实例包括(i) Fab片段，一种由VH、VpCL和CHl结构域组成的单价片段；(ii) F(ab’)2片段，一种包含在铰链区通过二硫键连接的2个Fab片段的二价片段；(iii) Fd片段，其由V1^P CHl结构域组成；(iv) Fv片段，其由抗体单臂的 Vh 和'结构域组成，(V) dAb 片段(Ward 等，(1989) Nature 341:544 546)，其由 Vh结构域组成；和(vi)分离的互补决定区(OTR)或(vii)两个或更多个分离⑶R的组合，其可任选通过合成接头连接。此外，虽然Fv片段的2个结构域V1^P \由不同的基因编码，但是可采用重组方法，通过合成接头将它们连接，所述合成接头使它们成为其中Vh和\区配对形成单价分子(称为单链Fv (scFv)的一条蛋白质链；参见例如Bird等(1988) Science242:423 426 ;以及 Huston 等(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA85:5879 5883)。这类单链抗体也意欲包括在术语抗体的“抗原结合部分”内。本文所用“抗体”和“抗体片段”可互换使用以描述本专利技术，除非另有明确说明。术语“超变区”、“HVR”或“HV”是指序列是超变的并形成结构上确定的环的抗体可变结构域的区域。抗体一般包含6个HVR ;3个在VH (H1、H2、H3)中，3个在VL (L1、L2、L3)中。在抗体分子中，VH结构域的3个HVR和VL结构域的3个HVR在三维结构中被连接在一起形成抗原结合表面。因为这些序列形成与靶抗原的三维结构互补的表面，因此HVR亦被称为互补决定区(OTR)。术语“⑶R”及其复数“⑶Rs”是指互补决定区(⑶R)，其中3个构成轻链可变区(CDRL1、CDRL2和CDRL3)的结合特性，3个构成重链可变区(CDRH1、CDRH2和CDRH3)的结合特性。CDR有助于抗体分子的功能活性，并且被包括支架区或构架区的氨基酸序列分开。本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：张秀青，
申请(专利权)人：AB生物科学公司，
类型：
国别省市：
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