重组抗人CD25嵌合抗体制造技术

本发明专利技术公开了一种重组抗人CD25人鼠嵌合抗体，其重链可变区的核酸序列如SEQ?ID?NO:1所示，轻链可变区的核酸序列如SEQ?ID?NO:2所示；其重链可变区的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:3所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:4所示；其完整重链核酸序列如SEQ?ID?NO:5所示，完整轻链核酸序列如SEQ?ID?NO:6所示；其完整重链氨基酸序列如SEQ?ID?NO:7所示，完整轻链氨基酸序列如SEQ?ID?NO:8所示。本发明专利技术所公开的嵌合抗体能特异性识别人CD25分子，其平衡解离常数为2.35×10-10?M，在预防器官移植排斥反应以及治疗某些自身免疫病和肿瘤等方面具有潜在应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于抗体药物
，具体涉及一种针对人T细胞表面⑶25分子的重组人/鼠嵌合抗体及其编码基因。
技术介绍
T细胞活化和细胞免疫应答有赖于IL-2与T细胞膜上的IL-2R结合。高亲和力的IL-2R是由a (CD25), β (CD75)和Y (CD132)链组成的异源三聚体复合物，其分子质量分别为55 kDa、75 kDa和64 kDa。α、βY和αβY与 IL-2的平衡解离常数常数(Kd)分别为10_8、10_9和10_n M0由此可见，α链在活化T细胞过程中具有核心作用。此外，β和Y链结构与I型细胞因子受体家族成员高度相似，而a链为独立一个家族。 人⑶25分子(又称为Tac抗原或IL_2Ra )是由251个氨基酸残基组成的跨膜糖蛋白，其分子质量约为55 kDa，血清中可溶性⑶25 (s-⑶25或s-Tac)分子质量约为45kDa。正常情况下，未受刺激的T细胞几乎不表达⑶25分子。当T细胞接受抗原刺激活化后即可高表达⑶25分子，形成高亲和力的IL-2R后与IL-2相互作用进而促进T细胞增殖和分化。然而，当进行器官移植(如肾脏、肝脏、心脏和骨髓)以及患有自身免疫病(如再生障碍性贫血、Crohn’s病、类风湿性关节炎、多发性硬化症、SLE、葡萄膜炎等)和肿瘤(如急性髓样淋巴瘤、CTCL、PTCL、覃样肉芽肿、成年T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤/非霍奇金淋巴瘤等)时，CD25 的表达水平也会增高(Waldmann TA, O’ Shea J. Current Opinion inimmunology, 1998， 10: 507-512. Morris JCj Waldmann TA. Ann Rheum Disj 2000， 59:il09-ill4. Waldmann TA. J Clin Immunol, 2007，27 (I): 1-18.)。由此可见，⑶25可成为一个预防器官移植排斥反应以及治疗某些自身免疫病和肿瘤的潜在革巴标(Church AC. Q J Med, 2003, 96: 91-102·)。人鼠嵌合抗体 basiliximab和人源化抗体daclizumab获准用于临床以来，在预防急性肾脏移植排斥反应中发挥着重要作用。国产的抗人⑶25人源化抗体(daclizumab仿制药)也于2011年获得SFDA颁发的批准文号。WuTac是我所上世纪80年代自主研发的具有自主知识产权的抗人⑶25单克隆抗体(IgGl κ), I期临床研究(SFDA批件号2003L03465)结果表明具有良好的药物耐受性和安全性。然而，毕竟鼠源性单克隆抗体是异源蛋白，因而仍可能存在一些影响药物疗效的问题。鉴于此，采用重组DNA技术将其改造成嵌合抗体或人源化抗体是解决此问题的重要途径之一。常规的扩增小鼠抗体可变区的方法是使用一组简并引物(Kettleborough CA,Saldanha J, Ansell KH, et al. Eur J Immunol, 1993, 23: 206-211·)。然而，由于抗体可变区基因的巨大多态性，现有的简并引物并不能完全覆盖所有的抗体基因序列，因此存在扩增不出或扩增出的基因序列存在突变等问题。本专利技术前期采用该法克隆出的序列就有多个碱基发生突变，从而影响了信号肽的活性和抗体的亲和力。RLM-RACE法(RNAligase-mediated rapid amplification of 5’ cDNA end)是一种不依赖于 DNA 模板序列的技术(Liu X, Gorovsky M. Nucleic Acids Research, 1993, 21 (21): 4954-4960),其为准确克隆出抗体可变区和信号肽序列以及与表达调控有关的5’非编码区(5’-UTR)提供了可能。
技术实现思路
本专利技术解决问题之一是采用RLM-RACE法准确克隆出WuTac鼠单抗的可变区序列。本专利技术提供的重组抗人⑶25嵌合抗体，其重链可变区的核苷酸序列如SEQ IDNO: I所示。本专利技术提供的重组抗人⑶25嵌合抗体，其轻链可变区的核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示。本专利技术提供的重组抗人⑶25嵌合抗体，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO:3所示。 本专利技术提供的重组抗人⑶25嵌合抗体，其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO:4所示。本专利技术解决问题之二是采用重组DNA技术构建了具有自主知识产权的抗人⑶25分子人鼠嵌合抗体IgGl κ。本专利技术提供的重组抗人⑶25嵌合抗体，其重链核苷酸序列如SEQ ID NO: 5所示。本专利技术提供的重组抗人⑶25嵌合抗体，其轻链核苷酸序列如SEQ ID N0:6所示，其轻链“+4A”突变为“+4G”，终止密码子“TAG”突变为“TGA”。本专利技术提供的重组抗人⑶25嵌合抗体，其重链氨基酸序列如SEQ ID NO: 7所示。本专利技术提供的重组抗人⑶25嵌合抗体，其轻链氨基酸序列如SEQ ID N0:8所示。本专利技术提供的重组抗人⑶25嵌合抗体基因序列在哺乳动物细胞(如HEK 293T、CHO-DHFR-和C0S-7)内进行了表达，并获得了目的抗体。本专利技术提供的基因序列在哺乳动物细胞内表达时在重链5’端“ATG”前添加了Kozak 序列 “GCCGCCACC”，3’ 端 “TGA” 后添加了 “GCT” 序列。本专利技术提供的基因序列在哺乳动物细胞内表达时在轻链5’端“ATG”前添加了Kozak序列“GCCGCCACC”，并将“+4A”突变为“+4G” ；且将3’端“TAG”突变成“TGA”后添加了 “GCT”序列。以该序列为模板可以在保持特异性和亲和力的前提下进化成全人源抗体或人源化抗体以及各种具有应用前景的产品，如scFv，Fab等。所述抗体不仅可用于预防器官移植排斥反应(如肾脏、肝脏、心脏和骨髓等)，而且对于治疗某些肿瘤如HTLV-I相关的成人T细胞淋巴瘤(ATL)、皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)、外周T细胞淋巴瘤(PTCL)、蕈样真菌病(MF)、非霍奇金淋巴瘤等以及某些自身免疫病如葡萄膜炎(Uveitis)、银屑病、类风湿性关节炎(RA)、系统性红斑狼疮(SLE) Xrohn' s病、多发性硬化症(MS)、再生障碍性贫血(Aplastic anaemia)等具有潜在应用价值。本专利技术所提供的重组抗人⑶25嵌合抗体能特异性识别人细胞(HEK 293T)表达的重组CD25分子胞外段以及PHA活化的人外周血单核细胞(PBMC)，其亲和力大小为2.35X10, M0其亲本抗体的I期临床研究表现出良好的安全性和耐受性。与其亲本抗体相比，其亲和力和特异性不仅得到保留，而且在人体内的免疫源性将大大降低，半衰期将显著延长，并能发挥抗体Fe区的生物学功能，因而更符合抗体药物应用于人体治疗的要求。附图说明附图I所示为采用RLM-RACE法克隆WuTac抗体可变区和信号肽序列以及5’ -UTR的琼脂糖凝胶电泳图，1、2分别为含有轻、重链可变区的片段。附图2所示为采用重组DNA技术构建抗人⑶25嵌合抗体重链和轻链基因的琼脂糖凝胶电泳图，3、6分别为完整重、轻链基因片段。附图3所示为采用Protein A亲和柱从稳定转染含有完整重、轻链基因的CHO-DHFR-细胞培养上清液中收获抗人C本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组抗人CD25嵌合抗体，其重链可变区的核苷酸序列如SEQ？ID？NO:1所示；其轻链可变区的核苷酸序列如SEQ？ID？NO:2所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：胡迪超，杨晓明，张爱华，
申请(专利权)人：武汉生物制品研究所有限责任公司，
类型：发明
国别省市：