本发明专利技术公开了一种重组抗人c‑Met嵌合抗体，其重链可变区核酸序列如SEQ ID:1所示，轻链可变区核酸序列如SEQ ID NO:2所示；其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID:3所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；其完整重链核酸序列如SEQ ID:5所示，完整轻链核酸序列如SEQ ID:6所示；其完整重链氨基酸序列如SEQ ID:7所示，完整轻链氨基酸序列如SEQ ID:8所示。本发明专利技术所公开的嵌合抗体能特异性与人c‑Met结合，在筛选阻断HGF/c‑Met信号转导通路进而抑制肿瘤生长的中和抗体药物研发方面具有重大作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于抗体药物
，具体涉及一种针对人间质表皮转化因子c-Met分子的重组嵌合抗体及其应用。
技术介绍
人间质表皮转化因子(c-Mesenchymal epithelial transition factor, c-Met)是一类具有自主磷酸化活性的跨膜受体，属于酪氨酸激酶受体超家族成员，也是肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)已知的惟一受体。其被受体激活后介导细胞信息传递，调控细胞骨架重排，是细胞增殖、分化和运动的重要调节因素。近年来研究发现，c-Met在我国发病率较高的肺癌、肝癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、脑胶质瘤等肿瘤组织中呈现异常高表达、突变或活性改变。且HGF/c-Met信号通路的激活程度与肿瘤侵袭和转移呈正相关。目前，c-Met已经成为抗肿瘤药物研究的一个重要靶点。2011年8月，第一个c-Met激酶抑制剂药物克唑替尼胶囊（crizotinib）获得FDA批准用于治疗晚期和ROS1阳性非小细胞肺癌。目前，还没有FDA批准的抗c-Met的中和抗体药物。传统鼠源抗体在人体内会产生人抗鼠抗体反应（Human anti-mouse antibody, HAMA），且不能有效地活化补体和Fc受体相关的免疫效应，抑制了其临床应用。而基因工程改造后的人鼠嵌合抗体很好的解决了这个问题。
技术实现思路
本专利技术解决问题之一是采用兼并引物法准确克隆出c-Met鼠单抗3E1D7的可变区序列。本专利技术提供的重组抗人c-Met嵌合抗体，其重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:1所示，其轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:2所示。本专利技术提供的重组抗人c-Met嵌合抗体，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。本专利技术解决的问题之二是采用重叠延伸PCR技术构建了具有自主知识产权的抗人c-Met嵌合抗体。本专利技术提供重组抗人c-Met嵌合抗体，其完整重链核酸序列如SEQ ID:5所示，完整轻链核酸序列如SEQ ID:6所示。本专利技术提供重组抗人c-Met嵌合抗体，其完整重链氨基酸序列如SEQ ID:7所示，完整轻链氨基酸序列如SEQ ID:8所示。本专利技术提供的重组抗人c-Met嵌合抗体基因序列在哺乳动物内进行了表达，并获得了目的抗体。以该序列为模板可以在保持特异性和亲和力的前提下进化成全人源抗体或人源化抗体以及各种具有应用前景的产品，如scFv, Fab等。本专利技术所提供的重组抗人c-Met嵌合抗体，能特异性的与肝细胞生长因子受体c-Met结合。与其亲本抗体相比，其亲和力和特异性不仅得到保留，而且在人体内的免疫源性将大大降低，因而更符合抗体药物应用于人体治疗的要求。附图说明图1为琼脂糖电泳鉴定抗人C-Met单克隆抗体3E1D7重链可变区、轻链可变区、人IgG1轻链恒定区基因Cκ和人IgG1重链恒定区基因Cγ1基因的PCR产物电泳图及嵌合抗体完整重、轻链慢病毒表达质粒酶切鉴定图，其中(a)是3E1D7重链可变区、轻链可变区基因电泳结果（泳道1为DL2000 Marker；泳道2为重链可变区条带339bp；泳道3为轻链可变区条带321bp）；(b)是人IgG1恒定区Cγ1和Cκ基因电泳结果（泳道1为DL2000 Marker； 泳道2为Cγ1基因条带约1000bp；泳道3是Cκ基因条带约350bp）；(c)是慢病毒表达质粒酶切鉴定（泳道1为DL2000 Marker；泳道2是嵌合抗体重链慢病毒表达载体酶切；泳道3是嵌合抗体轻链慢病毒表达载体酶切）。图2为荧光显微镜（×100）观察转染慢病毒质粒的HEK293T细胞，其中(a)和(b)为显微镜下观察嵌合抗体组的绿色荧光蛋白表达（a：普通光镜；b：荧光光镜）。图3为RT-PCR鉴定c-Met嵌合抗体重、轻链转录水平的表达（泳道1是DL2000 Marker；泳道2是完整嵌合抗体重链PCR产物，约1400bp；泳道3是完整嵌合抗体轻链PCR产物，约700bp）。图4为嵌合抗体ch3E1D7的还原性SDS-PAGE检测 (M：蛋白Marker； Lane1:细胞培养原液； lane2:滤过液；lane3:纯化后的嵌合抗体ch3E1D7)。图5是ELISA检测嵌合抗体与人HGFR的结合活性。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。此外应理解，在阅读了本专利技术讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本专利技术作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施案例一 鼠单抗3E1D7可变区基因及人恒定区基因的扩增及测序HEK293T细胞购自中国科学院上海细胞生物学研究所； 克隆载体pCR-Blunt购自Invitrogen公司；感受态大肠杆菌DH5α购自北京全式金生物技术有限公司；分泌抗c-Met中和抗体的杂交瘤细胞株3E1D7、慢病毒表达质粒pRRL-CMV、质粒pcDNA3.1-Cκ(含有人IgG1轻链恒定区基因Cκ)和质粒pcDNA3.1-IgG1(含有人IgG1重链恒定区基因Cγ1)均为本实验室构建并保存。TRIzol法从分泌抗人c-Met的杂交瘤细胞株3E1D7中提取细胞总RNA，并逆转录为cDNA。以合成的cDNA为模板，分别利用引物P1、P2和P3、P4扩增鼠单抗3E1D7的重、轻链可变区VH和VL基因。同时，以质粒pcDNA3.1-IgG1为模板，以P5、P6为引物扩增出人IgG1重链恒定区基因Cγ1。以质粒pcDNA3.1-Cκ为模板，以P7、P8为引物人IgG1轻链恒定区基因Cκ。扩增反应程序为：98 ℃预变性3 min；98 ℃变性15 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，32个循环；72 ℃再延伸10 min。1.5%琼脂糖凝胶结果显示，鼠源VH和VL基因的PCR产物分别可见约339和321bp的特异性条带，人源Cγ1和Cκ基因的PCR产物可见约1000和350bp的特异性条带，大小均与理论值相符（图1）。将上述扩增基因分别连入克隆载体pCR-Blunt中，转化感受态大肠杆菌DH5α，送苏州金唯智生物技术有限公司测序。测序结果通过与Kabat数据库比较，确定无论是在基因序列还是氨基酸序列上均具有唯一性。说明成功扩增克隆抗体3E1D7的VH和VL基因及人IgG1的Cγ1和Cκ基因。实施案例二 嵌合抗体完整重、轻链基因的扩增及慢病毒表达质粒构建利用P9、P10和P11、P12引物，通过重叠延伸PCR连接鼠源可变区基因与人源恒定区基因，得到完整的嵌合抗体重、轻链基因。测序结果表明成功得到含有嵌合抗体完整重链的质粒pCR-Blunt-ch3E-H和完整轻链的质粒pCR- Blunt- ch3E-L，H链基因大小为1410bp,轻链大小为723bp。分别将以上两个质粒用AgeⅠ和SalⅠ双酶切，同时用AgeⅠ和SalⅠ酶切慢病毒表达载体pRRL-CMV。用T4连接酶将目的片段和慢病毒表达载体连接，连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α，筛选阳性克隆，对获得慢病毒表达质粒pRRL-CMV-ch3E-H和pRRL-CMV-ch3E-L进行酶切及DNA序列测定。酶本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组抗人c‑Met嵌合抗体，其重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:1所示;其轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:2所示。
【技术特征摘要】
1.一种重组抗人c-Met嵌合抗体，其重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:1所示;其轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:2所示。2.一种重组抗人c-Met嵌合抗体，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。3.一种DNA分子，编码了权利要求1或2所述的重组抗人c-Met嵌合抗体。4.权利要求3所述的DNA分子，所述重组抗人c-Met嵌合抗体的重链核酸序列如SEQ ID NO:5所示；轻链核酸序列如SEQ ID NO:6所示。5.权利要求3所述的D...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭佳，蒋明，尹衍新，于丽华，毛玉婷，
申请(专利权)人：同济大学苏州研究院，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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