基于特异性单克隆或多克隆抗体建立的NY-ESO-1抗原检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于特异性单克隆或多克隆抗体建立的NY‑ESO‑1抗原检测方法，所述方法以NY‑ESO‑1重组蛋白为抗原制备特异性的抗NY‑ESO‑1抗体。将抗NY‑ESO‑1抗体与胶乳微球偶联制备抗体偶联物，然后将上述偶联物与外周血待测样品混合反应5‑10min，最后在检测546nm处吸光值，根据标准曲线获得样品中NY‑ESO‑1抗原浓度；本发明专利技术还提供一种化学发光检测方法，采用直接发光模式。本发明专利技术所述外周血中NY‑ESO‑1抗原的检测方法可在生化分析仪和化学发光免疫分析仪等大型自动化仪器上进行大样本自动化检测。本发明专利技术方法检测灵敏度0.01‑10ng/mL。

【技术实现步骤摘要】
(一)
本专利技术涉及一种体液中NY-ESO-1抗原检测方法，特别涉及一种基于特异性单克隆或多克隆抗体建立的NY-ESO-1抗原的检测方法。(二)
技术介绍
癌-睾丸抗原(cancer-testis antigen，CTA)作为一种重要的肿瘤相关抗原，在多种肿瘤细胞中表达，但在正常组织中仅限于睾丸和胚胎组织。CTA具有促进肿瘤形成，抵抗肿瘤凋亡，促进肿瘤转移等生物学功能。NY-ESO-1是癌-睾丸抗原家族中的重要成员，在肿瘤抗原中具有较强免疫原性，在多种肿瘤中广泛表达，在正常组织中几乎不表达，目前已发现20多个CD4+或CD8+T细胞识别表位，并在多种肿瘤内可检测到自发性免疫反应。NY-ESO-1表达和体内自发性免疫应答与肿瘤诊断、预后相关，在肿瘤治疗领域也有重要作用。由于生殖细胞不表达HLA分子和血睾屏障存在，针对CTA的肿瘤免疫治疗一般对正常组织细胞不产生免疫毒性，目前NY-ESO-1被认为是肿瘤免疫治疗的理想靶抗原。NY-ESO-1抗原首先由Chen等通过重组cDNA文库血清学分析技术(Serological analysis of recombinant cDNA expression libraries，SEREX)从食管癌组织中筛选得到的。此后，多项研究显示NY-ESO-1在神经母细胞瘤、滑膜肉瘤、恶性黑素瘤、卵巢癌等多种肿瘤组织中均表达较高，在结直肠癌、肝癌、尿路上皮癌、多发性骨髓瘤、肺癌中也有一定程度表达。NY-ESO-1基因家族包括NY-ESO-1、LAGE-1和ESO3三个成员，均定位于X染色体q28，基因序列具有一定相似性。不同于NY-ESO-1和LAGE-1特异性表达于肿瘤组织，ESO3广泛表达于人体各种正常组织，不具肿瘤限制性。NY-ESO-1基因mRNA约700bp，最长可达747bp，编码区通常543bp，编码蛋白质相对分子量约18kD，由180个氨基酸组成，其N端有富含甘氨酸，C端存在疏水性氨基酸序列，有潜在跨膜区域。NY-ESO-1作为免疫原性较强的CTA，可活化CD4+和CD8+T淋巴细胞，诱导机体产生针对肿瘤的细胞和体液免疫应答。NY-ESO-1肽链中T淋巴细胞识别表位主要以HLA-A2和HLA-DR限制性抗原肽为主。NY-ESO-1激发的自身免疫应答可能会被肿瘤微环境抑制，从而影响抗肿瘤效应。因此，肿瘤免疫治疗需要通过改造免疫细胞，增强免疫应答和抗肿瘤效应来实现。目前文献报道p155-163(QLSLLMWIT)、p157-165(SLLMWITQC)和p157-167(SLLMWITQCFL)三个抗原肽可诱导NY-ESO-1阳性肿瘤患者产生CTL反应，可应用于肿瘤免疫治疗。NY-ESO-1作为一种重要的肿瘤相关抗原，在肿瘤早期诊断，发生发展，治疗效果等方面具有重要价值。NY-ESO-1在多种肿瘤组织中表达，而几乎不在正常组织中表达，其在肿瘤诊断中具有较高特异性。NY-ESO-1及其自身抗体与临床常规肿瘤标志物联合可提高疾病诊断的准确度和灵敏度。研究发现NY-ESO-1抗体与CEA和CA19-9等常规肿瘤标志物联合检测胃癌时，III期和IV期胃癌患者诊断准确率提高了11.2％，在所有胃癌患者中提高了5.8％。Peng等对112例鼻咽癌患者和对照对比，结果发现NY-ESO-1和VCA-IgA自身抗体联合筛查可提高检测的灵敏度和特异性，提示NY-ESO-1特异性自身抗体检测对鼻咽癌患者有早期诊断作用，可作为一个潜在联合筛查标志(Peng YH,et al,Oncology letters 2014,8:1096-1102.)。也有研究检测了237例食管鳞状细胞癌患者和134例对照组，结果表明NY-ESO-1是食管鳞状细胞癌早期诊断潜在标志之一(Xu YW,et al.The American journal of gastroenterology2014,109:36-45.)。Lai等对50例滑膜肉瘤，155例胃肠道间质瘤，135例梭形细胞肉瘤和77例多样肉瘤进行免疫组化后发现NY-ESO-1在滑膜肉瘤中呈现持续稳定表达，可鉴别于其他肉瘤(Lai JP,et al.Oncoimmunology 2012,1:1409-1410.)。NY-ESO-1在肿瘤预后判断也有重要意义，研究发现肿瘤细胞表达NY-ESO-1提示预后较差。在乳腺髓样癌患者中，雌激素受体阴性者肿瘤组织NY-ESO-1阳性率高于雌激素受体阳性者，NY-ESO-1阳性患者生存期低于NY-ESO-1阴性患者。也有研究对头颈部鳞癌患者进行多因素分析后认为NY-ESO-1是其不良预后的独立指标。此外，NY-ESO-1也是非小细胞肺癌预后标志之一(Ademuyiwa FO,et al.PloS one 2012,7:e38783；Laban S,et al.International journal of cancer.2014,135:1142-1152；John T,et al.PloS one 2013,8:e67876.)。在肿瘤免疫治疗中，CTA优势是能选择性激发肿瘤患者体内特异性细胞和体液免疫反应，而几乎不损害正常组织。NY-ESO-1作为CTA中具有较强免疫原性成员，在肿瘤治疗中扮演着重要角色。CTA参与初期阶段胚胎发育和干细胞自我更新，其在肿瘤组织中表达局限于具有干细胞特性的细胞，CT基因表达细胞可能是异常肿瘤干细胞克隆增殖的结果。表达CTA的肿瘤细胞失去了分化能力，并且可能参与肿瘤复发和转移。肿瘤干细胞中CT基因表达已应用于肿瘤复发和转移的治疗。有研究从神经胶质瘤细胞系和组织中分离出肿瘤干细胞，相较于分化细胞，肿瘤干细胞中NY-ESO-1表达显著升高。此外，在肿瘤干细胞中CT基因包括NY-ESO-1的启动子区域显示较高组蛋白乙酰化和甲基化水平。由于HLA I类抗原表达水平不随分化状态改变，CTA可以作为在肿瘤干细胞的表面抗原，CT基因如NY-ESO-1被建议用于胶质瘤患者肿瘤干细胞靶向疫苗。近年来已研制出的一系列CT抗原相关治疗肿瘤疫苗，如以人工合成的NY-ESO-1抗原肽疫苗，以牛痘NY-ESO-1及鸟痘NY-ESO-1抗原肽作为病毒疫苗，都产生了不同程度的治疗效果。HLA-A2限制性抗原肽的NY-ESO-1多肽疫苗已被用于临床试验，且接种疫苗后可产生CD8+T细胞免疫应答。Karbach等研究辅以不完全福氏佐剂和CpG 7909的NY-ESO-1肽(p157-165)疫苗免疫HLA-A2阳性晚期肿瘤患者，可检测到持续T细胞免疫反应，该研究认为联合佐剂的NY-ESO-1肽疫苗有望抑制肿瘤生长(Karbach J,et al.International journal of cancer 2010,126:909-918.)。另一项研究对NY-ESO-1b肽和不完全福氏佐剂接种高危上皮性卵巢癌患者安全性和免疫原性进行评估，结果发现3例患者在25，38和52个月出现完全临床缓解。在国内，中国药品食品监督管理局通过了NY-ESO-1b多肽疫苗评定，其能够诱导肝癌患者产生特异性细胞免疫应答，从而有效抑制术后残留肿瘤细胞，有望成为一种有效肿瘤辅助治疗手段。过继性细胞免疫治疗(adopt本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于特异性单克隆或多克隆抗体建立的NY‑ESO‑1检测方法，其特征在于所述方法为：以NY‑ESO‑1重组蛋白为抗原制备抗NY‑ESO‑1抗体，将抗NY‑ESO‑1抗体与胶乳微球偶联制备抗体偶联物；然后将待测样品与试剂a混合，25‑37℃反应3‑5min，再加入抗体偶联物，25‑37℃反应5‑10min，检测546nm处吸光值，根据标准曲线获得待测样品中NY‑ESO‑1重组蛋白浓度；所述抗NY‑ESO‑1抗体为抗NY‑ESO‑1单克隆IgG抗体或抗NY‑ESO‑1多克隆IgG抗体；所述试剂a质量组成为：35g/L聚乙二醇‑6000，牛血清白蛋白5g/L，溶剂为pH6.8的缓冲液；所述标准曲线按如下方法制备：用NY‑ESO‑1重组蛋白为抗原制备抗NY‑ESO‑1特异性抗体，将抗NY‑ESO‑1特异性抗体与胶乳微球偶联制备特异性抗体偶联物，再将NY‑ESO‑1重组蛋白按0‑250ng/ml梯度浓度用含体积浓度0.1‑1％牛血清白蛋白的缓冲液稀释成稀释液，以无抗原成份的含所述牛血清白蛋白的缓冲液为空白对照，然后将试剂b与不同浓度稀释液混合，25‑37℃反应5‑10min，最后再加入特异性抗体偶联物，25‑37℃反应5‑10min，分别测定546nm处吸光值，以吸光值为纵坐标，以稀释液中NY‑ESO‑1重组蛋白浓度作为横坐标制作标准曲线；所述抗NY‑ESO‑1特异性抗体为抗NY‑ESO‑1特异性单克隆IgG抗体或抗NY‑ESO‑1特异性多克隆IgG抗体；所述试剂b组成同试剂a。...

【技术特征摘要】
1.一种基于特异性单克隆或多克隆抗体建立的NY-ESO-1检测方法，其特征在于所述方法为：以NY-ESO-1重组蛋白为抗原制备抗NY-ESO-1抗体，将抗NY-ESO-1抗体与胶乳微球偶联制备抗体偶联物；然后将待测样品与试剂a混合，25-37℃反应3-5min，再加入抗体偶联物，25-37℃反应5-10min，检测546nm处吸光值，根据标准曲线获得待测样品中NY-ESO-1重组蛋白浓度；所述抗NY-ESO-1抗体为抗NY-ESO-1单克隆IgG抗体或抗NY-ESO-1多克隆IgG抗体；所述试剂a质量组成为：35g/L聚乙二醇-6000，牛血清白蛋白5g/L，溶剂为pH6.8的缓冲液；所述标准曲线按如下方法制备：用NY-ESO-1重组蛋白为抗原制备抗NY-ESO-1特异性抗体，将抗NY-ESO-1特异性抗体与胶乳微球偶联制备特异性抗体偶联物，再将NY-ESO-1重组蛋白按0-250ng/ml梯度浓度用含体积浓度0.1-1％牛血清白蛋白的缓冲液稀释成稀释液，以无抗原成份的含所述牛血清白蛋白的缓冲液为空白对照，然后将试剂b与不同浓度稀释液混合，25-37℃反应5-10min，最后再加入特异性抗体偶联物，25-37℃反应5-10min，分别测定546nm处吸光值，以吸光值为纵坐标，以稀释液中NY-ESO-1重组蛋白浓度作为横坐标制作标准曲线；所述抗NY-ESO-1特异性抗体为抗NY-ESO-1特异性单克隆IgG抗体或抗NY-ESO-1特异性多克隆IgG抗体；所述试剂b组成同试剂a。2.如权利要求1所述基于特异性单克隆或多克隆抗体建立的NY-ESO-1检测方法，其特征在于所述抗NY-ESO-1单克隆IgG抗体为IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3或IgG4中的一种；所述抗NY-ESO-1多克隆IgG抗体含F(ab)’2特异性抗体片段。3.如权利要求1所述基于特异性单克隆或多克隆抗体建立的NY-ESO-1检测方法，其特征在于所述标准曲线按如下方法制备：用NY-ESO-1重组蛋白为抗原免疫家兔制备兔抗NY-ESO-1特异性抗体，将兔抗NY-ESO-1特异性抗体与胶乳微球偶联制备特异性抗体偶联物，将NY-ESO-1重组蛋白用含体积浓度0.25％牛血清白蛋白的缓冲液稀释成0ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、250ng/mL的稀释液，以含所述牛血清白蛋白的缓冲液为空白对照，将所述不同浓度的稀释液与试剂b与混合，25-37℃反应3-5min，然后加入特异性抗体偶联物，25-37℃反应5-10min，检测546nm处吸光值，以吸光值为纵坐标，以稀释液中NY-ESO-1重组蛋白浓度作为横坐标制作标准曲线。4.如权利要求1所述基于特异性单克隆或多克隆抗体建立的NY-ESO-1检测方法，其特征在于所述胶乳微球以直径为80-400nm、表面活化基团为-COOH或-NH2的质量浓度10％的微球胶乳液形式加入。5.如权利要求1所述基于特异性单克隆或多克隆抗体建立的NY-ESO-1检测方法，其特征在于所述抗体偶联物制备方法为：(1)胶乳微球活化：将胶乳微球与pH6.5、0.05mol/L MES缓冲液、水、吐温-20混合，涡旋振荡混匀；向混合液中加入50mg/mL NHS水溶液和10mg/mL碳二亚胺水溶液，涡旋振荡15-45分钟，再超声10次，每次超声5秒，间隔30秒，超声能量9000kJ；超声结束后混合液过Sepha...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱永良，杨赛赛，黄建，孙红祥，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33