一种抗体酸性峰的纯化方法技术

本发明专利技术涉及一种抗体酸性峰的纯化方法，具体的，在2～8℃下，包含以下步骤：(1)使用MEP HyperCel填料，使用电导率由小变大的洗脱液洗脱，收集目标峰洗脱液，其中洗脱液中含有5～10mmol/L的苯丁酸钠；(2)将步骤(1)中的目标峰洗脱液进行弱阳离子层析，使用丁酸盐作为缓冲盐洗脱目标峰。通过上述方法进行纯化后，能加强对抗体酸性峰的去除，可有效的将酸性峰控制在11％‑14％范围内。

【技术实现步骤摘要】
一种抗体酸性峰的纯化方法
本专利技术涉及抗体纯化领域，具体涉及一种抗体酸性峰纯化的方法。
技术介绍
单克隆抗体在表达过程中，经过多种翻译修饰之后，会导致电荷异质性，体现在等电点不同，产生一系列不同等电点的抗体。经过高分辨率的离子交换柱分析，出现连续性的峰，而非单一的峰。电荷异质性影响到单克隆抗体的稳定性及生物学活性，因此在生产中，电荷异质性成为关键质量属性，需要严格控制。由于电荷异质性差异非常小，很难通过一步层析就可以将抗体酸性峰降到可以接受的范围内。需要极高分辨率的离子交换填料，再配合其他的层析手段，比如亲和层析柱ProteinA等。虽然ProteinA层析效果对单克隆抗体的其他杂质如HCP、DNA、轻链等去除效果最佳，但对酸性峰的去除效果不如高分辨率的离子交换填料。配合高分辨率的离子交换填料GE公司的SPSepharoseHighPerformance，效果并不如意，且成本是非常昂贵的，GE公司的ProteinA通常需要十几万一升，使用寿命较短，另外，亲和填料含有蛋白A成分，使用后蛋白A会脱落引入新的杂质，需要建立检测蛋白A的方法和去除工艺。使用复合填料利用常规的去除方法，由于是满载上样，粒径较大，分辨率本身就不高，去除酸性峰的效果并不理想，给下游杂质的去除整加压力。另外，使用其他填料的组合，如使用阳离子交换和阴离子交换，在常规方法去除抗体酸性峰的效果也不是很理想。目前，在控制抗体酸性峰的含量在医药纯化领域是一个普遍的难题。
技术实现思路
本专利技术根据上述技术背景的不足，本文选用pall公司的MEP填料和弱阳离子作为纯化手段，有效降低酸性峰的含量，减少后续纯化的压力。具体的，本专利技术提供了一套可适于抗体酸性峰的纯化工艺，在2～8℃下，包含以下步骤：(1)使用Pall公司的MEPHyperCel填料，使用电导率由小变大的洗脱液洗脱，收集目标峰洗脱液，其中洗脱液中含有5～10mmol/L的苯丁酸钠；(2)将步骤(1)中所述目标峰洗脱液进行弱阳离子层析，使用丁酸盐作为缓冲盐洗脱目标峰。在一些实施方案中，弱阳离子层析的填料为CMSephadexC-25、TOYOPEARLCM-650(S)、UniCM-30S。在弱阳离子的层析过程中，进行洗脱时的缓冲液其丁酸盐的浓度常为150～250mmol/L。在另一些实施方案中，纯化工艺包含以下步骤：(1)使用Pall公司的MEPHyperCel填料，上样平衡后，先使用pH6.5的30mmol/L柠檬酸盐缓冲液洗脱，再使用pH7.0的50mmol/L柠檬酸盐缓冲液洗脱，收集目标峰洗脱液，其中柠檬酸盐缓冲液中均含有5～10mmol/L的苯丁酸钠；(2)将步骤(1)中所述目标峰洗脱液进行弱阳离子层析，平衡后使用pH7.0的200mmol/L丁酸盐缓冲液洗脱目标峰。在一些实施方案中，丁酸盐为丁酸钠、丁酸钙、吲哚丁酸钾。本专利技术的一些实施方案中，抗体是TNFα抗体或其抗原结合部分，如英夫利昔单抗(infliximab)、阿达木单抗(adalimumab)、Golimumab都是TNFα类抗体。本专利技术有益效果在于：a.该工艺具有去除酸性峰杂质效果好，产品回收率高等优点，样品可以直接上样，前处理工作较少，工艺简单易行仅通过两步层析，就可将酸性峰控制在11％～14％围内；b.在低温条件下，通过在洗脱液中添加苯丁酸钠和丁酸盐，能有效对酸性峰进行分离，并且对浊度、宿主细胞等均有较好控制。具体实施方式以下所述的是本专利技术的优选实施方式，本专利技术所保护的不限于以下优选实施方式。应当指出，对于本领域的技术人员来说在此专利技术创造构思的基础上，做出的若干变形和改进，都属于本专利技术的保护范围。实施例中所用的原料或耗材均可以通过商业途径或公知方法制备获得。实施方案中用到的层析系统为GE公司的AKTApurifer，色谱柱为PallLRC15X080-200V01柱。实施方案中用到的色谱基质MEP-HyperCel为Pall公司的一款复合填料，具有疏水和离子交换两种机制，填料由4巯基乙基吡啶偶联刚性纤维素组成。CMSephadexC-25(CM葡聚糖凝胶C-25)为弱阳离子交换机制，填料为羧甲基交联葡聚糖，TOYOPEARLCM-650(S)为TOSOH公司生产，填料为羧甲基交联聚甲基丙烯酸，UniCM-30S为弱阳离子交换机制，填料为羧甲基交联聚丙烯酸酯。本专利技术实施例中使用的是CHO细胞表达的阿达木单抗(adalimumab)的发酵液，将发酵罐下来的料液离心过滤后进行色谱纯化实验。本专利技术以下实施例是采用两步离心法，第一次离心用4000g/min，离心10min，将CHO细胞及大颗粒离心除去，收集上清液；第二次用8000g/min去除细胞碎片及细小颗粒，收集上清液。将离心后的料液板式过滤，经过浊度计检测料液浊度为6NTU，符合要求后用于以下实验。实施例1复合填料层析a.准备：取料液(抗体浓度为2.18mg/ml)400ml，使用GE公司的层析系统AKTApurifer，选用PallLRC15X080-200V01柱，内含25mlMEPHyperCel填料。样品和柱子始终保持在4℃。b.平衡：平衡缓冲液为150mmol/LPBS(pH7.3)，保持流速为4.5ml/min。c.上样：每毫升填料上样量为35mg抗体，上样体积约400ml。d.冲洗：用150mmol/LPBS(pH7.3)的平衡缓冲液去冲洗至基线平稳。e.洗脱：分两步洗脱，洗脱缓冲液一为：30mmol/L柠檬酸盐+10mmol/L苯丁酸钠(pH6.5)，洗脱出一个峰为酸性峰杂质舍弃。待平衡后，用洗脱缓冲液二：50mmol/L柠檬酸盐+10mmol/L苯丁酸钠(pH7.0)进行洗脱，分离出来一个高大的峰，收集第二个峰，大约得到40ml。检测酸性峰的方法参考文献《离子交换色谱对抗VEGFR2单抗的电荷异质性分析》中的检测方法，使用高分辨率的离子交换柱对目的抗体进行检测。计算抗体的收率为93.54％，检测酸性峰的含量为20.71％。弱阳离子GECMSephadexC-25层析a.准备：加水稀释，加入约1.2倍的水，用丁酸调节pH至7.0，将稀释后的料液用不锈钢板式过滤器Millipore过0.20μm的滤膜，得到90ml样品(抗体浓度为9.10mg/ml)。样品和柱子始终保持在4℃。使用GE公司的层析系统AKTApurifer，选用PallLRC15X080-200V01柱，内含27mlGE公司的CMSephadexC-25(CaptoSPImpRes)填料。b.平衡：平衡缓冲液为60mmol/LPBS(pH7.0)，保持流速为4ml/min。c.上样：每毫升填料上样量为30mg抗体，上样体积约90ml。d.冲洗：用50mmol/L丁酸盐缓冲液(pH7.0)的冲洗缓冲液去冲洗至基线平稳。e.洗脱：用200mmol/L丁酸盐缓冲液(pH7.0)进行洗脱，洗脱出一个峰，对该峰进行分段收集，半峰高之前的峰不收集，半峰高后开始收集，收集至200mAu开始停止。检测方法同上，计算抗体的收率为75.31％，检测酸性峰的含量为13.72％。实施例2复合填料层析a.准备：取料液(抗体浓度为2.5mg/ml)350ml，使用GE公司的层析系统AKTApurifer，选用P本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗体酸性峰的纯化方法，其特征在于，在2～8℃下，包含以下步骤：(1)使用MEP HyperCel填料，使用电导率由小变大的洗脱液洗脱，收集目标峰洗脱液，其中洗脱液中含有5～10mmol/L的苯丁酸钠；(2)将步骤(1)中所述目标峰洗脱液进行弱阳离子层析，使用丁酸盐作为缓冲盐洗脱目标峰。

【技术特征摘要】
2015.03.19 CN 20151012234251.一种抗体的纯化方法，其特征在于，在2～8℃下，包含以下步骤：(1)使用MEPHyperCel填料，上样平衡后，先使用pH6.5的30mmol/L柠檬酸盐缓冲液洗脱，再使用pH7.0的50mmol/L柠檬酸盐缓冲液洗脱，收集目标峰洗脱液，其中柠檬酸盐缓冲液中均含有5～10mmol/...

【专利技术属性】
技术研发人员：邬君，马旭通，林小鹊，杨彬，孙文正，苏彦景，
申请(专利权)人：广东东阳光药业有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44