稳健的抗体纯化制造技术

本发明专利技术涉及从含有抗体的溶液中分离宿主细胞蛋白质（HCP）、抗体片段和低分子量物质的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术涉及从含有抗体的溶液中分离宿主细胞蛋白质（HCP）、抗体片段和低分子量物质的方法。现有技术A蛋白以及单克隆抗体纯化由于抗体（mAb）被用于药物应用，所以需要其具有极高的纯度[A. Jungbauer, G. Carta, in: Protein Chromatography, Process Development and Scale-Up; WILEY-VCH Verlag, Weinheim (Germany) 2010]。A蛋白首先是56 kDa 的表面蛋白，最初发现于细菌金黄色葡萄球菌 （Staphylococcus aureus） 的细胞壁中。其由 spa 基因编码而其调控由DNA拓扑结构、细胞渗透性以及称为ArlS-ArlR的双组分系统所控制。由于其结合免疫球蛋白的能力，其已被用于生物化学研究中。其原本由折叠成三螺旋束的五个同源Ig结合结构域构成。每个结构域均能够结合来自许多哺乳动物物种的蛋白质，最值得注意的是 IgG。其结合大部分免疫球蛋白的Fc区内的重链，并且在人类VH3家族的情况下，也结合Fab区内的重链。通过在血清中的这些相互作用，其中IgG分子以错误的取向结合（相对于正常的抗体功能），细菌破坏调理作用和吞噬作用。通常采用哺乳动物细胞培养来生产市场上现有的大多数治疗用单克隆抗体（mAb）。生产这些药物抗体一般从装有中国仓鼠卵巢（CHO）细胞（其将所述抗体分泌到细胞外液中）的悬浮液的生物反应器开始。然后使所得抗体经受一系列工序（包括澄清、过滤和纯化），其移除细胞、细胞碎片、宿主细胞蛋白质（HCP）、脂质、DNA、病毒、细菌、抗体聚集体等。此系列工序经常被称为下游工序（DSP）。最常用的DSP包括一个或两个结合-洗脱层析纯化步骤后接一个或两个流通精炼步骤。一般的下游纯化工序采用装满基于多孔珠的层析介质的填充柱或基于膜的设备。将这些单元操作串联采用并且每一项均靶向在流通精炼或结合/洗脱捕获模式中清除一种颗粒杂质。精炼介质的主要目标之一是降低杂质的浓度（例如，参考mAb的浓度，HCP降至< 10 ppm）。总而言之，一般的抗体纯化工序包括初始的A蛋白亲和捕获步骤后接一个或多个离子交换精炼步骤，其目的在于降低一种或多种关键杂质（如，例如，宿主细胞蛋白质（HCP）、抗体片段和其它低分子量物质）的水平。从抗体分离抗体片段尤为困难，因为它们具有相似的特性，尤其是含有FC的片段。后者通常无法用A蛋白层析分离。通常，在某些条件下于A蛋白捕获步骤之后进行进一步的抗体纯化步骤（例如，CEX、AEX）以移除残留的杂质。这需要在那些纯化步骤之前对抗体保持溶液进行多项调整（例如，pH调整、传导性调整）。此外，这些pH和传导性的改变使目标分子产生应激，并生成抗体相关的杂质（例如，抗体聚集体、抗体片段）。近来，工业界已经出现一个值得关注的趋势，即：试图减少纯化步骤数，同时保持产品质量属性。使用生物反应器获得更高表达效价的技术的使用也在工业界呈上升趋势。这两个趋势的结合已经导致更多的产品被加样到柱上，从而导致相当昂贵的层析介质的负担增加以及更低的产品纯度，而这两种结果都是不期望的。为了提高对所需蛋白质产品（如抗体或特殊蛋白质片段）的层析纯化的选择性，在改变纯化方法的同时已经开发了各种层析材料。尤其是，分离材料表面的特定衍生化应当导致在澄清的细胞培养基中更有选择性地将不期望的杂质从所需产品分离。但这些特殊且复杂的表面衍生化使得这些层析材料的生产较市售产品昂贵得多，从而致使其在工业规模纯化上的用途不那么有吸引力。在层析材料领域的其它进展集中在基于有机基底的分离材料上，这是因为基于硅材料的市售材料通常受到碱性环境的影响并丧失稳定性（尤其是在再生期间）。基于有机聚合物的固定相可在宽泛的pH条件范围上工作。因此，可在高pH条件下强力清洁聚合树脂。但现有的聚合固定相在高性能生物分子分离所用的中等至高压力条件下是一定程度上可压缩的。在存在非溶剂的情况下由含有二乙烯基苯（DVB）的混合物的悬浮聚合生产的常规大孔共聚物代表了具有宽泛的孔径分布和表面积范围的聚合物。此类聚合物珠在例如US 4,686,269中公开。这些聚合物珠由乙烯基芳族单体制备，具有0.5至50 µm的平均粒径。但其在常用于生产规模的层析柱的高压力条件下并非是刚性的。用于层析的聚合物珠的刚性是至关重要的，这是因为其与多孔聚合物固定相一道提供了分离期间所必需的压力和流动特性。目标要解决的问题是对稳健（robust）且可靠的抗体纯化步骤的需求，该步骤有效适用于宽泛的条件下的流通模式，其中关键杂质（如HCP和抗体片段）的水平被降低。专利技术概述本专利技术涉及从含有抗体的溶液中分离宿主细胞蛋白质（HCP）、抗体片段和低分子量物质的方法，其中使含有抗体的溶液与疏水性层析材料接触一段适当的时间，由此所述抗体主要保留在溶液中而HCP、抗体片段和低分子量物质被所述疏水性层析材料所吸附。详细而言，所述疏水性层析材料为颗粒状并且其由交联的乙烯基苯、乙基苯乙烯、聚(乙基)苯乙烯-二乙烯基苯制成，或由聚(乙基)苯乙烯-二乙烯基苯 乙二醇-二甲基丙烯酸酯树脂制成。优选地，所述树脂由交联的聚合物构成，所述交联的聚合物由苯乙烯和二乙烯基苯以98 : 2至最高10 : 90的重量%比例构成。在改进形式中，颗粒状材料由以98 : 2至最高10 : 90的重量%比例与共聚物交联的聚苯乙烯组成，所述共聚物为二乙烯基苯和乙二醇二甲基丙烯酸酯的共聚物。为了进行从所需抗体移除和分离宿主细胞蛋白质（HCP）、抗体片段和低分子量物质，使水性澄清细胞培养溶液与疏水性层析材料接触，所述水性澄清细胞培养溶液的pH值范围为2–11，优选5–9并且传导性范围为1–150 mS/cm，优选2–50 mS/cm。优选地，所述水溶液以范围在150–1000 cm/min，优选300–900 cm/min的流速通过。在特别优选的实施方案中，在A蛋白亲和结合步骤之后进行宿主细胞蛋白质（HCP）、抗体片段和低分子量物质的分离。如果需要，纯化序列包括采用离子交换树脂处理。通常使用颗粒状的疏水性层析分离材料进行分离，所述分离材料的平均粒径范围为10 µm至600 µm，优选20 µm至150 µm，最优选20 µm至63 µm。这种尺寸的合适疏水性多孔聚合物珠的孔径范围为优选4–500 nm，更优选10–30 nm，最优选13 nm至25 nm。如以上所指出的，纯化序列可包括至少一种采用离子交换树脂的处理，其优选为对于A蛋白的分离特异性的。采用此类离子交换树脂处理与采用多孔疏水性聚合物珠处理的结合有利地导致HCP耗尽至多至<10 ng并且同时移除沥滤出的A蛋白。如果所述疏水性聚合物颗粒由交联的乙烯基苯、聚(乙基)苯乙烯-二乙烯基苯组成，或由聚(乙基)苯乙烯-二乙烯基苯 乙二醇-二甲基丙烯酸酯树脂组成，则在此情况下会获得特别好的清洁效果。本专利技术的目标是，具体地讲，疏水性层析分离材料用于从含有抗体的溶液中分离宿主细胞蛋白质（HCP）、抗体片段和低分子量物质的用途，所述疏水性层析分离材料的孔径范围为4 nm至500 nm，优选10 nm–30 nm，最优选13 nm至25 nm。本专利技术所用的疏水性层析分离材料优本文档来自技高网...

【技术保护点】
从含有抗体的溶液中分离宿主细胞蛋白质（HCP）、抗体片段和低分子量物质的方法，其特征在于，使含有抗体的溶液与疏水性层析材料接触一段时间，由此所述抗体保留在溶液中而HCP、抗体片段和低分子量物质被所述疏水性层析材料所吸附。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.03.04 US 61/9477611.从含有抗体的溶液中分离宿主细胞蛋白质（HCP）、抗体片段和低分子量物质的方法，其特征在于，使含有抗体的溶液与疏水性层析材料接触一段时间，由此所述抗体保留在溶液中而HCP、抗体片段和低分子量物质被所述疏水性层析材料所吸附。2.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述疏水性层析材料是由交联的乙烯基苯、交联的乙基乙烯基苯、聚苯乙烯-二乙烯基苯、聚苯乙烯-二乙烯基苯、聚乙基苯乙烯-二乙烯基苯制成的或由聚乙基苯乙烯-二乙烯基苯 乙二醇-二甲基丙烯酸酯树脂制成的颗粒。3.根据权利要求1或2的方法，其特征在于，应用了由交联的聚合物构成的层析材料，所述交联的聚合物由单乙烯基芳族单体和二乙烯基芳族单体以98 : 2至最高10 : 90的重量%比例构成。4.根据权利要求1或2的方法，其特征在于，应用了由交联的聚合物构成的层析材料，所述交联的聚合物由单乙烯基芳族单体和二乙烯基芳族与二(甲基)丙烯酸酯单体的混合物以98:2至最高10: 90的重量%比例构成。5.根据权利要求1-3中一项或多项的方法，其特征在于，应用了颗粒状层析材料，所述颗粒状层析材料由以98 : 2至最高10 : 90的重量%比例与共聚物交联的聚苯乙烯或聚(乙基)苯乙烯组成，所述共聚物为二乙烯基苯与乙二醇甲基丙烯酸酯的共聚物。6.根据权利要求1-5中一项或多项的方法，其特征在于，应用了水溶液，所述水溶液的pH值范围为2–11，优选5–9，并且其传导性范围为1–150 mS/cm，优选2–50 mS/cm。7.根据权利要求1-6中一项或多项的方法，其特征在于，所述水溶液以范围在150–1000 cm/min，优选300–900 cm/min的流速通过。8.根据权利要求1-7中一项或多项的方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：R施库达斯，M约恩克，B埃德尔曼，S布劳恩，M科兹洛夫，MT斯通，K加利波，
申请(专利权)人：默克专利股份公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE