一种六胜肽的纯化方法技术

本发明专利技术提供了一种六胜肽的纯化方法，包括：(1)溶解：将待纯化的六胜肽粗品溶解在醋酸‑醋酸钠溶液中，过滤得到滤液；(2)粗纯：将步骤(1)得到的滤液上样至强阳离子交换柱，用粗纯流动相进行梯度洗脱，收集洗脱液；(3)脱盐：将步骤(2)收集的洗脱液上样至反相聚合物柱，用脱盐流动相进行梯度洗脱，收集六胜肽溶液，减压浓缩与冷冻干燥得到六胜肽。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于多肽纯化
，具体地，本专利技术涉及一种六胜肽的纯化方法。
技术介绍
六胜肽又称六元胜肽，具有肉毒素的全部功能，且无毒性。六胜肽是一种含有六个氨基酸的活性多肽，氨基酸序列为Ac-Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg-NH2，它能抑制神经传导，避免肌肉过度收缩，从而防止细纹形成。作为皮肤除皱成分，广泛应用于各种高级美容化妆品中。瑞士传奇集团护肤实验室于2010年研发的MAGICCARE魔法护理六胜肽平皱紧致原液是六胜肽美容产品的尖端代表。另外，国内外少有六胜肽分离纯化方法的相关文献，还没有文献具体研究六胜肽相关大规模的分离纯化方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于克服现有六胜肽纯化方法存在的缺点，提供一种成本低、纯度高，适合产业化的六胜肽纯化方法。本专利技术提供的六胜肽的纯化方法包括：(1)溶解：将待纯化的六胜肽粗品溶解在醋酸-醋酸钠溶液中，过滤得到滤液；(2)粗纯：将步骤(1)得到的滤液上样至强阳离子交换柱，用粗纯流动相进行梯度洗脱，收集洗脱液；(3)脱盐：将步骤(2)收集的洗脱液上样至反相聚合物柱，用脱盐流动相进行梯度洗脱，收集六胜肽溶液，减压浓缩与冷冻干燥得到六胜肽。前述的纯化方法，步骤(1)中，待纯化的六胜肽粗品与醋酸-醋酸钠溶液的比率是(0.5g-100g):(20ml-1000ml)，优选地，待纯化的六胜肽粗品与醋酸-醋酸钠溶液的比率是(0.5g-10g):(20ml-100ml)。前述的纯化方法，所述醋酸-醋酸钠溶液是浓度为0.01-0.1mol/L、pH值为3.9-4.1的醋酸-醋酸钠溶液。前述的纯化方法，所述粗纯流动相由初始缓冲液流动相和洗脱缓冲液流动相组成，其中，所述初始缓冲液流动相是醋酸-醋酸钠溶液，所述洗脱缓冲液流动相是加入氯化钠的初始缓冲液流动相；优选地，所述初始缓冲液流动相是浓度为0.01-0.1mol/L、pH值为3.9-4.1的醋酸-醋酸钠溶液，所述洗脱缓冲液流动相是加入0.5-1.5mol/L氯化钠的初始缓冲液流动相。前述的纯化方法，所述脱盐流动相由流动相A和流动相B组成，其中，所述流动相A是超纯水，所述流动相B是色谱纯甲醇。前述的纯化方法，步骤(2)中，所述粗纯流动相梯度是初始缓冲液流动相:洗脱缓冲液流动相由100:0到(80-60):(20-40)。前述的纯化方法，步骤(3)中，所述脱盐流动相梯度是流动相A:流动相B由(100-95):(0-5)到(90-80):(10-20)。前述的纯化方法，所述粗纯流动相由初始缓冲液流动相和洗脱缓冲液流动相组成，其中，所述初始缓冲液流动相是醋酸-醋酸钠溶液，所述洗脱缓冲液流动相是高浓度、高pH值的醋酸-醋酸钠缓冲液；优选地，所述初始缓冲液流动相是浓度为0.01-0.1mol/L、pH值为3.9-4.1的醋酸-醋酸钠溶液，所述洗脱缓冲液流动相由A相和B相组成，A相是浓度为0.01-0.1mol/L、pH值为5.5-6.2的醋酸-醋酸钠溶液，B相是浓度为0.5-1.5mol/L、pH值为5.5-6.2的醋酸-醋酸钠溶液。前述的纯化方法，所述脱盐流动相由流动相A和流动相B组成，其中，所述流动相A是超纯水，所述流动相B是色谱纯甲醇。前述的纯化方法，步骤(2)中，所述粗纯流动相梯度是初始缓冲液流动相:洗脱缓冲液流动相由100:0到(80-60):(20-40)。前述的纯化方法，步骤(3)中，所述脱盐流动相梯度是流动相A:流动相B由(100-95):(0-5)到(90-80):(5-10)。采用本专利技术的技术方案，至少具有如下有益效果：1.本专利技术方法将强阳离子交换柱与反相聚合物柱结合使用，先使用强阳离子交换柱对六胜肽进行粗纯，除去了大部分杂质，再使用反相聚合物柱进行脱盐，得到进一步纯化的六胜肽，极大地提高了纯化效率。2.本专利技术方法节省了整个纯化过程中流动相的成本，且纯化工艺较为环保。3.本专利技术方法两种柱子交替使用，有效地弥补了单一柱子难以完全分离粗肽中不同结构、不同化学性质的杂质，得到的六胜肽纯度高(大于95％)，且收率高。附图说明图1是根据本专利技术第一种具体实施方式的方法纯化得到的六胜肽的质谱图。图2是根据本专利技术第一种具体实施方式的方法纯化得到的六胜肽的高效液相色谱图。图3是根据本专利技术第二种具体实施方式的方法纯化得到的六胜肽的质谱图。图4是根据本专利技术第二种具体实施方式的方法纯化得到的六胜肽的高效液相色谱图。具体实施方式为充分了解本专利技术之目的、特征及功效，借由下述具体的实施方式，对本专利技术做详细说明，但本专利技术并不仅仅限于此。目前，就六胜肽纯化方法而言，普通存在成本高昂但效果不理想的问题，针对该问题，本专利技术提供了一种利用离子交换高效液相色谱分离纯化六胜肽的方法，该方法依次包括如下步骤：(1)溶解：将待纯化的六胜肽粗品溶解在醋酸-醋酸钠溶液中，过滤得到滤液；(2)粗纯：将步骤(1)得到的滤液上样至强阳离子交换柱，用粗纯流动相进行梯度洗脱，收集洗脱液；(3)脱盐：将步骤(2)收集的洗脱液上样至反相聚合物柱，用脱盐流动相进行梯度洗脱，收集六胜肽溶液，减压浓缩与冷冻干燥得到六胜肽。在步骤(1)中，待纯化的六胜肽粗品是采用固相合成法制得，在将待纯化的六胜肽粗品溶解于醋酸-醋酸钠溶液时，优选地，按照待纯化的六胜肽粗品与醋酸-醋酸钠溶液的比率是(0.5g-100g):(20ml-1000ml)进行溶解，更优选地，按照待纯化的六胜肽粗品与醋酸-醋酸钠溶液的比率是(0.5g-10g):(20ml-100ml)进行溶解。将待纯化的六胜肽粗品溶解于醋酸-醋酸钠溶液后，优选采用1mol/L氢氧化钠调节pH值至3.9-4.1，进行超声处理，随后用滤膜(例如0.45μm的滤膜)过滤，并收集滤液别用。在步骤(2)中，色谱柱采用强阳离子交换柱，所谓强阳离子交换柱是指在高纯度的惰性硅胶表面键合一种新型的聚合磺酸基阳离子交换配位体，这种独特的键合结构是一种稳定的聚合包膜结构，比普通的聚合物离子交换柱柱效更高，且具有更好的机械强度和重现性。在本专利技术中，采用的强阳离子交换柱是填料为琼脂糖微球的强阳离子交换柱，其中琼脂糖微球可以是SP高流速琼脂糖微球(SPBio-sepFF)，其粒径为50-160μm，可通过常规市购获得，例如西安交大保赛生物技术股份有限公司生产的SP高流速琼脂糖微球就可用于本专利技术中。在步骤(3)中，色谱柱采用反相聚合物柱，所谓反相聚合物柱是指固定相的极性比流动性的极性弱的一类聚合物柱。在本专利技术中，采用的反相聚合物柱是填料为苯乙烯二乙烯苯型填料的反相聚合物柱，例如填料为SBCMCIGEIF型反相色谱填料、粒径为30-50μm，可通过常规市购获得，例如成都科谱生物有限公司生产的SBCMCIGEIF型反相色谱填料可用于本专利技术中。步骤(2)中使用的粗纯流动相由初始缓冲液流动相和洗脱缓冲液流动相组成，步骤(3)中使用的脱盐流动相由流动相A和流动相B组成。在本专利技术的第一种具体实施方式中，步骤(2)中使用的初始缓冲液流动相是醋酸-醋酸钠溶液，洗脱缓冲液流动相是加入氯化钠的初始缓冲液流动相；优选地，初始缓冲液流动相是浓度为0.01-0.1mol/L、pH值为3.9-4.1的醋酸-醋酸钠溶液，洗脱缓冲液流动相是加入0.5-1.5mol本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种六胜肽的纯化方法，其特征在于，包括：(1)溶解：将待纯化的六胜肽粗品溶解在醋酸‑醋酸钠溶液中，过滤得到滤液；(2)粗纯：将步骤(1)得到的滤液上样至强阳离子交换柱，用粗纯流动相进行梯度洗脱，收集洗脱液；(3)脱盐：将步骤(2)收集的洗脱液上样至反相聚合物柱，用脱盐流动相进行梯度洗脱，收集六胜肽溶液，减压浓缩与冷冻干燥得到六胜肽。

【技术特征摘要】
1.一种六胜肽的纯化方法，其特征在于，包括：(1)溶解：将待纯化的六胜肽粗品溶解在醋酸-醋酸钠溶液中，过滤得到滤液；(2)粗纯：将步骤(1)得到的滤液上样至强阳离子交换柱，用粗纯流动相进行梯度洗脱，收集洗脱液；(3)脱盐：将步骤(2)收集的洗脱液上样至反相聚合物柱，用脱盐流动相进行梯度洗脱，收集六胜肽溶液，减压浓缩与冷冻干燥得到六胜肽。2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤(1)中，待纯化的六胜肽粗品与醋酸-醋酸钠溶液的比率是(0.5g-100g):(20ml-1000ml)，优选地，待纯化的六胜肽粗品与醋酸-醋酸钠溶液的比率是(0.5g-10g):(20ml-100ml)。3.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述醋酸-醋酸钠溶液是浓度为0.01-0.1mol/L、pH值为3.9-4.1的醋酸-醋酸钠溶液。4.根据权利要求1-3任一项所述的纯化方法，其特征在于，所述粗纯流动相由初始缓冲液流动相和洗脱缓冲液流动相组成，其中，所述初始缓冲液流动相是醋酸-醋酸钠溶液，所述洗脱缓冲液流动相是加入氯化钠的初始缓冲液流动相；优选地，所述初始缓冲液流动相是浓度为0.01-0.1mol/L、pH值为3.9-4.1的醋酸-醋酸钠溶液，所述洗脱缓冲液流动相是加入0.5-1.5mol/L氯化钠的初始缓冲液流动相。5.根据权利要求1-3任一项所述的纯化方法，其特征在于，所述脱盐流动相由流动相A和流动相B组成，其中，所述流动相A是超纯水，所述流动相B是色谱纯甲醇。6.根据权利要求4或5所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭添，苏晨灿，李乾，张忠旗，王惠嘉，王万科，韩广，王慧，高长波，赵金礼，杨小琳，
申请(专利权)人：陕西慧康生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：陕西;61