蛋白质展示方法技术

本发明专利技术涉及用于针对抗靶分子之期望活性筛选多肽的方法。特别地，本发明专利技术涉及通过在革兰氏阴性细菌细胞中表达多肽并使所述细胞透化来针对抗靶分子之期望活性筛选多肽的方法。本发明专利技术还涉及在细菌细胞中包装基因文库的方法。

Protein display method

The present invention relates to methods for screening polypeptides directed against desired activity of target molecules. In particular, the present invention relates to methods for screening polypeptides by targeting the desired activity of anti target molecules by expressing polypeptides in gram negative bacterial cells and by making the cells permeable. The present invention also relates to methods for packaging gene libraries in bacterial cells.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】蛋白质展示方法专利
本专利技术涉及用于针对抗靶分子之期望活性筛选多肽的方法。特别地，本专利技术涉及通过在革兰氏阴性细菌细胞中表达多肽并使所述细菌细胞透化来针对抗靶分子之期望活性筛选多肽的方法。本专利技术还涉及在细菌细胞中包装基因文库的方法。专利技术背景最早的蛋白质展示(proteindisplay)方法是噬菌体展示(Smith，1985)，在该方法中，目的蛋白质与噬菌体的外壳蛋白(outer-coatprotein)之一融合，在此处其可以与蛋白质的野生型拷贝一起存在。例如，基于M13丝状噬菌体的展示平台使用与giII蛋白的融合。其他展示方法包括“体外”展示方法，在该方法中，使用细胞翻译提取物表达蛋白质，并通过物理连接(例如核糖体展示、mRNA展示)或通过连接在共用骨架上或包封在膜内实现蛋白质与编码核酸之间的偶联，例如，在体外区室化(invitrocompartmentalization，IVC)中，mRNA在胶束悬液中翻译，所述胶束悬液还可包含mRNA和蛋白质二者的微珠(磁性或琼脂糖(sepharose))捕获系统。蛋白质展示的另一个方法是微生物表面展示，其涉及所表达蛋白在微生物细胞外部的靶向定位，所述微生物细胞为革兰氏阴性或革兰氏阳性真细菌或酵母。使蛋白质与将蛋白质连接到细胞表面的锚结构域融合。所述锚结构域可具有指导酯化或共价连接至细胞壁的基序，或者锚结构域可以是与暴露的环区内与整合膜蛋白的融合。由于生产的可扩展性，微生物表面展示不仅可用于从多样化文库中筛选改进的蛋白质变体，还可用于呈递用于疫苗接种的抗原，或作为酶的细胞骨架以用于工业生物技术。蛋白质展示方法常应用于亲和蛋白质(如抗体)的进化(evolution)。单分子展示方法在历史上是最受欢迎的，但是其缺点在于高背景以及亲和尺度(affinityscale)之间的低分辨率。通过体外展示或通过噬菌体系统鉴定的抗体通常被重新编排以用于在大肠杆菌周质中表达，虽然周质的产率相比于胞质中的表达通常极差。但是，当抗体在胞质中以高产率表达时，在几乎所有情况下，其形成不溶的包涵体，必须费力地再折叠包涵体并测试其活性。因此，依然需要蛋白质展示方法，特别是用于筛选亲和蛋白质展示文库和酶文库的蛋白质展示方法。专利技术概述本专利技术人开发了一种蛋白质展示方法，在该方法中，在革兰氏阴性细菌细胞的胞质中产生被针对期望活性进行筛选的多肽，以及将编码所述多肽的多核苷酸包装在也保留在细菌细胞中的裂解缺陷型噬菌体中。使一个或更多个细菌细胞膜透化，从而使细菌细胞可以与靶分子接触以针对期望活性进行筛选。因此，本专利技术提供了针对抗靶分子之期望活性筛选多肽的方法，所述方法包括：a)对包含编码多肽之外源多核苷酸的革兰氏阴性细菌细胞进行培养，从而在细胞中产生所述多肽，b)使得裂解缺陷型噬菌体包装所述编码多肽的多核苷酸，其中所述裂解缺陷型噬菌体保留在细菌细胞中，c)透化：i)细菌细胞的外膜，或ii)细菌细胞的内膜和外膜，d)使所述细菌细胞与靶分子接触，以及e)针对期望活性筛选多肽，其中，多肽被细菌细胞壁或内膜保留在细菌细胞内和/或多肽连接至细菌细胞壁或内膜。在一个实施方案中，多肽可以被表达并被细菌细胞壁保留在细菌细胞的胞质内。因此，在一个实施方案中，所述方法包括使细菌细胞的内膜和外膜透化。所述多肽可具有足够的尺寸从而使所述多肽被完整的细胞壁保留在包含经透化内膜和外膜的细菌细胞内。或者，如果所述多肽的尺寸足够小，其可穿过完整细胞壁扩散。在一个实施方案中，为了阻止所述多肽穿过细胞壁扩散，使所述多肽与至少第二多肽缔合以形成蛋白质复合物，所述蛋白质复合物保留在经透化细菌细胞内和/或连接至细菌细胞壁。在一个实施方案中，所述多肽与第二多肽或其亚基融合。在一个具体实施方案中，所述第二多肽选自：i)具有的分子大小使蛋白质复合物保留在经透化细菌细胞壁内的多肽；ii)DNA结合蛋白；iii)细菌细胞壁结合蛋白；和/或iv)裂解缺陷型噬菌体的噬菌体外壳蛋白(coatprotein)。尽管可使用任何合适的方法使细菌内膜和细菌外膜透化，但是在一个实施方案中，通过一种或更多种去污剂或有机溶剂使细菌内膜和细菌外膜透化。在一个实施方案中，所述一种或更多种去污剂是非离子去污剂。在另一个实施方案中，所述非离子去污剂选自：癸酰基-N-甲基葡糖酰胺(Decanoyl-N-methylglucamide，Mega10)、二甲基辛基氧化膦(demithyloctylphosphineoxide，Apo8)、正辛基-β-D-硫代吡喃葡糖苷(n-octyl-β-D-thioglucopyranoside，8TGP)，以及癸酰基-N-甲基葡糖酰胺(Mega10)和二甲基辛基氧化膦(Apo8)的混合物。或者，可利用有机溶剂如氯仿使细菌细胞的内膜和外膜透化。例如，在一个实施方案中，通过将细菌细胞在用氯仿饱和的水溶液中孵育来使细菌细胞的内膜和外膜透化。在一个具体实施方案中，将细菌细胞在用氯仿饱和的水溶液中在约25℃下孵育约10分钟。在本专利技术的另一个实施方案中，多肽在细菌细胞中产生并连接至细菌细胞的内膜。因此，使细菌细胞的外膜透化并使细胞壁至少部分地水解，而使内膜保持完整。因此，在本专利技术方法的一个实施方案中：i)使细菌外膜透化；ii)使细菌细胞壁至少部分地水解；以及iii)使所述多肽连接至内膜。在一个具体实施方案中，利用溶菌酶使细菌细胞壁至少部分地水解。在另一个实施方案中，多肽与连接在内膜上的蛋白质融合。在一个具体实施方案中，多肽连接至内膜的外面。在另一个实施方案中，多肽与细菌噬菌体外壳蛋白缔合。在一个具体实施方案中，多肽与λ细菌噬菌体衣壳蛋白(capsidprotein)gpD的任一端融合。在另一个实施方案中，多肽与P2细菌噬菌体衣壳蛋白gpL的N端融合。编码所述多肽的DNA可以是基因组DNA和/或附加体DNA(episomalDNA)。在一个实施方案中，编码所述多肽的多核苷酸是质粒、粘粒、噬菌粒或噬菌体DNA。在一个实施方案中，所述裂解缺陷型噬菌体是温和噬菌体，其选自λ噬菌体、186、P2、186和P2的杂交体、和/或P4。裂解缺陷型噬菌体可以作为噬菌体存在于革兰氏阴性细菌细胞中或作为原噬菌体整合到宿主细胞基因组中。因此，在一个实施方案中，所述裂解缺陷型噬菌体是原噬菌体。在一个具体实施方案中，细菌细胞包含裂解缺陷型的λ、186、P2、186和P2的杂交体、和/或P4原噬菌体。在另一个实施方案中，细菌细胞包含P2和P4原噬菌体。在一个具体实施方案中，细菌细胞包含λ原噬菌体。在另一个实施方案中，细菌细胞包含186和P2原噬菌体的杂交体。在一个实施方案中，使裂解缺陷型噬菌体包装编码所述多肽的多核苷酸包括，诱导细菌细胞中的原噬菌体活化以产生噬菌体，其中所述噬菌体包装多核苷酸。在一个实施方案中，诱导原噬菌体活化包括在细菌细胞中产生一种或更多种噬菌体活化蛋白。在一个具体实施方案中，细菌细胞包含P2和P4原噬菌体，所述方法包括在细菌细胞中产生P2和/或P4活化蛋白。在一个实施方案中，所述P2和/或P4活化蛋白选自P2cox、P2ogr、P4δ和/或P4ε中的一种或更多种。在另一个实施方案中，诱导原噬菌体活化包括使细菌细胞中的一种或更多种噬菌体阻遏蛋白失活。在一个实施方案本文档来自技高网...

【技术保护点】
针对抗靶分子之期望活性筛选多肽的方法，所述方法包括：a)对包含编码所述多肽之外源多核苷酸的革兰氏阴性细菌细胞进行培养，从而在所述细胞中产生所述多肽，b)使裂解缺陷型噬菌体包装编码所述多肽的所述多核苷酸，其中所述裂解缺陷型噬菌体保留在所述细菌细胞内，c)透化：i)所述细菌细胞的外膜，或ii)所述细菌细胞的内膜和外膜，d)使所述细菌细胞与所述靶分子接触，以及e)针对期望活性筛选多肽，其中，所述多肽被细菌细胞壁或内膜保留在所述细菌细胞内和/或所述多肽连接至细菌细胞壁或内膜。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.06.29 AU 20119025681.针对抗靶分子之期望活性筛选多肽的方法，所述方法包括：a)对包含编码所述多肽之外源多核苷酸的革兰氏阴性细菌细胞进行培养，从而在所述细胞中产生所述多肽，b)使裂解缺陷型噬菌体包装编码所述多肽的所述多核苷酸，其中所述裂解缺陷型噬菌体保留在所述细菌细胞内，c)透化：i)所述细菌细胞的外膜，或ii)所述细菌细胞的内膜和外膜，d)使所述细菌细胞与所述靶分子接触，以及e)针对期望活性筛选多肽，其中，所述多肽被细菌细胞壁或内膜保留在所述细菌细胞内和/或所述多肽连接至细菌细胞壁或内膜。2.根据权利要求1所述的方法，其包括使所述细菌细胞的内膜和外膜透化。3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述多肽至少与第二多肽缔合以形成保留在经透化细菌细胞内和/或连接至细菌细胞壁的蛋白质复合物。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述多肽与所述第二多肽或其亚基融合。5.根据权利要求3所述的方法，其中所述第二多肽选自：i)具有的分子大小使所述蛋白质复合物保留在所述经透化细菌细胞壁内的多肽；ii)DNA结合蛋白；iii)细菌细胞壁结合蛋白；和/或iv)所述裂解缺陷型噬菌体的噬菌体外壳蛋白。6.根据权利要求2所述的方法，其中利用一种或更多种去污剂或有机溶剂使细菌内膜和细菌外膜透化。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述去污剂是非离子去污剂。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述非离子去污剂选自：癸酰基-N-甲基葡糖酰胺(Mega10)、二甲基辛基氧化膦(Apo8)、正辛基-β-D-硫代吡喃葡糖苷(8TGP),以及癸酰基-N-甲基葡糖酰胺(Mega10)和二甲基辛基氧化膦(Apo8)的混合物。9.根据权利要求6所述的方法，其中所述有机溶剂是氯仿。10.根据权利要求9所述的方法，其中通过将所述细菌细胞在用氯仿饱和的水溶液中孵育来使所述细菌细胞的内膜和外膜透化。11.根据权利要求10所述的方法，其中在25℃下将所述细菌细胞在用氯仿饱和的水溶液中孵育10分钟。12.根据权利要求1所述的方法，其中：使所述细菌外膜透化；使所述细菌细胞壁至少部分地水解；以及使所述多肽连接至所述内膜。13.根据权利要求12所述的方法，其中利用溶菌酶使所述细菌细胞壁至少部分地水解。14.根据权利要求12或权利要求13所述的方法，其中使所述多肽与连接至所述内膜的蛋白质融合。15.根据权利要求12或13所述的方法，其中使所述多肽连接至所述内膜的外面。16.根据权利要求1、2或者5至13中任一项所述的方法，其中所述编码多肽的多核苷酸是质粒、粘粒、噬菌粒或噬菌体DNA。17.根据权利要求1、2或者5至13中任一项所述的方法，其中所述裂解缺陷型噬菌体是温和噬菌体，其选自λ噬菌体、186、P2、186和P2的杂交体以及P4。18.根据权利要求1、2或者5至13中任一项所述的方法，其中所述裂解缺陷型噬菌体是原噬菌体。19.根据权利要求18所述的方法，其中所述细菌细胞包含裂解缺陷型λ、186、P2、186和P2的杂交体和/或P4原噬菌体。20.根据权利要求19所述的方法，其中所述细菌细胞包含P2和P4原噬菌体。21.根据权利要求18所述的方法，其中使所述裂解缺陷型噬菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：马修·贝亚斯利，本·基费尔，
申请(专利权)人：亲和生物科学公司，
类型：发明
国别省市：澳大利亚,AU