蛋白质免疫检测方法技术

本发明专利技术涉及生物检测技术领域，特别是涉及一种蛋白质免疫检测方法其包括如下步骤：将目标蛋白转移到固相载体上；封闭；加入一抗并孵育洗涤；加入工程化酶并孵育洗涤；加入腺苷三磷酸以及镁离子并孵育洗涤；加入过氧化物酶并孵育洗涤；加入发光试剂成像显色。该方法，采用新的信号增强原理，其能够通过酶促反应修饰目标蛋白进而增加信号来源，同时使一抗的特异性和反应性被有选择的加强，从而在加强信号的同时，并不会放大噪音，进而有效提高信噪比。其同时节约一抗，降低成本。本发明专利技术的过氧化物酶单独使用，具有很强的通用性，不需要针对鼠源或兔源的一抗选择不同的二抗，因而经济实用。该方法，可适用于WB及ELISA中。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物检测
，特别是涉及一种蛋白质免疫检测方法。
技术介绍
WesternBlotting技术(蛋白质印迹技术)是将蛋白质样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转移到固相载体上，利用抗原抗体的特异性结合反应来检测目标蛋白的表达或者修饰状态的方法。WesternBlotting技术是目前生物化学实验中最常用到的检测蛋白的方法，但是，该方法很多时候都会遇到背景过高、信号太弱等问题，从而影响实验结果分析和实验进度。目标蛋白(即抗原)在总蛋白中的丰度、抗体结合的特异性和反应性、二抗孵育信号放大过程中信噪比的控制等因素，都会对结果的一致性和稳定性造成相当大的影响。一抗的特异性和反应性决定了最终信号的质量。目前的一抗分为单克隆抗体和多克隆抗体，通常价格高昂，而其中单抗的效果较好价格也更高。而对于一些低丰度蛋白，通常为了得到清晰的条带，不得不增加一抗的浓度，这不仅使得成本上升，也容易造成非特异性条带增多，使得信噪比下降。对于一抗的特异性和结合能力的提升将会对Westernblotting的效果产生积极的影响。但目前市场上针对Westernblotting的增强试剂大多以增强化学发光反应的信号为手段，从而放大最终得到的信号。其局限性也是显而易见的，这种放大过程将信号和噪音同时放大。
技术实现思路
基于此，有必要针对蛋白质免疫检测方法中噪音同时放大的问题，提供一种降低噪音放大的蛋白质免疫检测方法。一种蛋白质免疫检测方法，包括如下步骤：S1、将目标蛋白转移到固相载体上；S2、将目标蛋白用封闭剂封闭；S3、加入一抗，孵育后洗涤；S4、加入工程化酶，孵育后洗涤；所述工程化酶能够与所述一抗特异性结合并与所述目标蛋白反应；S5、加入腺苷三磷酸以及镁离子，孵育后洗涤；S6、加入过氧化物酶，孵育后洗涤；S7、加入发光试剂成像显色。本专利技术的蛋白质免疫检测方法，采用新的信号增强原理，其能够通过酶促反应修饰目标蛋白进而增加信号来源，同时使一抗的特异性和反应性被有选择的加强，从而在加强信号的同时，并不会放大噪音，进而有效提高信噪比。本专利技术的蛋白质免疫检测方法，同时可以大量节约一抗的使用量，进而有效降低成本。本专利技术的过氧化物酶单独使用，具有很强的通用性，不需要针对鼠源或兔源的一抗选择不同的二抗，因而经济实用。上述蛋白质免疫检测方法，主要应用于Westernblotting，同时在其它蛋白质免疫检测中，如ELISA中也有一定的应用前景，为蛋白质的检测和定量提供了更广泛的选择。在其中一个实施例中，所述固相载体为聚偏氟乙烯膜。在其中一个实施例中，所述封闭剂为脱脂牛奶。在其中一个实施例中，所述一抗为α-Tubulin抗体。在其中一个实施例中，所述一抗的稀释比例为1:1000～1:100000。在其中一个实施例中，所述孵育的温度为4～37℃，所述孵育的时间为5min～16h。在其中一个实施例中，所述洗涤采用TBST缓冲液洗涤。在其中一个实施例中，所述过氧化物酶为辣根过氧化物酶。在其中一个实施例中，所述发光试剂为ECL发光试剂。在其中一个实施例中，所述蛋白质免疫检测方法为蛋白质印迹检测。附图说明图1为实施例1的显色图案。图2为对比例1的显色图案。图3为测试例1的显色图案。图4为测试例2的显色图案。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施方式，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方式仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。本专利技术提供了一种蛋白质免疫检测方法。以下以蛋白质印迹(WesternBlotting)为例进行说明，可以理解的是，本专利技术的检测方法还适用于其它蛋白质免疫检测中，例如ELISA(酶联免疫吸附试验Enzymelinkedimmunosorbentassay)。具体地，蛋白质免疫检测方法，包括如下步骤：S1、将目标蛋白转移到固相载体上。在蛋白质印迹(WesternBlotting)中，在步骤S1之前还包括获取目标蛋白的步骤。获取目标蛋白的步骤具体包括：首先，提取细胞蛋白；接着，测定所提取的细胞蛋白的浓度；然后，将细胞蛋白电泳分离。其中，提取细胞蛋白的目的是，获得高丰度、高品质的目标蛋白。提取细胞蛋白一般是利用将细胞裂解、破碎、使蛋白质释放的原理。提取细胞蛋白的方法很多，鉴于不同的实际情况以及对蛋白性质的要求不同，可以选用不同的裂解方法。在本实施方式中，采用RIPA裂解液对细胞进行裂解。其中，浓度测定可以采用Bradford法(考马斯亮蓝法)、Lowry法(Folin-酚试剂法)、或BCA法等。在本实施方式中，采用BCA法进行蛋白测定。其中，电泳分离可以采用本领域技术人员所公知的各种方法，在此不再赘述。在步骤S1中，固相载体又叫作固相支持物、或转移膜，其主要作用是，为目标蛋白提供支撑载体。根据固相载体与目标蛋白的结合能力(也就是单位面积的固相载体能结合目标蛋白的载量)、固相载体的孔径、后续显色检测以及其它因素来选择合适的固相载体。优选地，固相载体选自NC膜(硝酸纤维素膜)、尼龙膜、或PVDF膜(聚偏氟乙烯膜)。在本实施方式中，固相载体为PVDF膜。S2、将目标蛋白用封闭剂封闭。步骤S2的主要目的是，为了避免作为检测试剂的一抗与固相载体发生非特异性结合，使非特异性背景提高。步骤S2将固相载体上的潜在结合位点进行封闭处理，从而使一抗无法与固相载体进行非特异性结合。其中，封闭剂一般采用脱脂奶粉或BSA(牛血清白蛋白)。在本实施方式中，封闭剂为脱脂奶粉。S3、加入一抗，孵育后洗涤。其中，一抗也叫作第一抗体，其的主要目的是，与目标蛋白(即抗原)产生抗原-抗体特异性结合。根据目标蛋白的不同，可以选择合适的一抗来实现与目标蛋白的特异性结合。在本实施方式中，一抗为α-Tubulin抗体。优选地，一抗的稀释比例为1:1000～1:100000。这样在保证良好的信号强度下，可以达到节省一抗的使用量的效果。加入一抗之后进行孵育操作，孵育操作的目的是使一抗和目标蛋白充分进行特异性结合。优选地，孵育的温度为4～37℃，孵育的时间为5min～16h。孵育操作之后进行洗涤操作，洗涤操作的目的是，去除未进行特异性结合的一抗。优选地，洗涤采用TBST缓冲液洗涤。当然，可以理解的是，也可以采用其它洗涤液进行洗涤，例如PBST。S4、加入工程化酶，孵育后洗涤。其中，工程化酶的主要作用是，能够与一抗产生特异性结合并与目标蛋白反应，从而识别目标蛋白并在目标蛋白上加特异性修饰。优选地，工程化酶的稀释比例为1:2000。其中，步骤S4的孵育和洗涤，可以参照步骤S3中的孵育洗涤，也可做适当的调整，在此不再赘述。S5、加入腺苷三磷酸以及镁离子，孵育后洗涤。在步骤S5中，加入腺苷三磷酸与镁离子的主要目的是，通过ATP和镁离子的协同作用，使工程化酶与一抗快速产生特异性结合，使反应催化，从而达到增强信号的来源。其中，腺苷三磷酸(adenosinetriphosphate，简写ATP)又叫腺嘌呤核苷三磷酸、或三磷酸腺苷。腺苷三磷酸以及镁离子可以混合加入，也可分别加入。混合加入可以是腺苷三磷酸以及镁离子简单混合，也可以是以腺苷三磷酸镁的形式加入。分别加入可以是先加入腺苷三磷酸后加入镁离子，也可以是先加入镁离子后加入腺苷三磷酸。同样地本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蛋白质免疫检测方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、将目标蛋白转移到固相载体上；S2、将目标蛋白用封闭剂封闭；S3、加入一抗，孵育后洗涤；S4、加入工程化酶，孵育后洗涤；S5、加入腺苷三磷酸以及镁离子，孵育后洗涤；S6、加入过氧化物酶，孵育后洗涤；S7、加入发光试剂成像显色。

【技术特征摘要】
1.一种蛋白质免疫检测方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、将目标蛋白转移到固相载体上；S2、将目标蛋白用封闭剂封闭；S3、加入一抗，孵育后洗涤；S4、加入工程化酶，孵育后洗涤；S5、加入腺苷三磷酸以及镁离子，孵育后洗涤；S6、加入过氧化物酶，孵育后洗涤；S7、加入发光试剂成像显色。2.根据权利要求1所述的蛋白质免疫检测方法，其特征在于，所述固相载体为聚偏氟乙烯膜。3.根据权利要求1所述的蛋白质免疫检测方法，其特征在于，所述封闭剂为脱脂牛奶。4.根据权利要求1所述的蛋白质免疫检测方法，其特征在于，所述一抗为α-Tubulin抗体。5.根据权利要求1所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘华东，
申请(专利权)人：苏州拜恩翰斯生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32