一种制备蛋白质UGTCs4的方法技术

本发明专利技术公开了一种制备蛋白质UGTCs4的方法，蛋白质UGTCs4具有藏红花酸糖基转移酶活性。本发明专利技术所提供的方法包括如下步骤：培养工程菌，得到所述蛋白质UGTCs4；所述工程菌为将重组表达载体导入宿主菌得到的重组菌；所述重组表达载体为将所述蛋白质UGTCs4的编码基因插入表达载体得到的重组质粒。实验证明，利用本发明专利技术所提供的方法制备的蛋白质UGTCs4可顺序糖基化藏红花酸形成藏红花素苷5和藏红花素苷3，对生产藏红花素苷5和/或藏红花素苷3、制备具有藏红花酸糖基转移酶功能的产品或催化藏红花酸发生糖基化均具有重要应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及一种制备蛋白质UGTCs4的方法。
技术介绍
藏红花又叫番红花、西红花，为多年生的鸢尾科植物番红花(Crocus sativus L.)的干燥柱头，是我国的一种名贵中药。藏红花总苷是从藏红花中提取的色素类化合物，其主要成分为藏红花素(crocus)、藏红花酸(crocetin)及其衍生物，其中藏红花素是藏红花酸与不同糖结合而成的一系列酯苷，是藏红花的主要活性成分之一，具有抗血小板聚集、抗血栓形成、抗心肌缺血、抗癌等多种药理作用，而且几乎无毒副作用。现有研究表明，藏红花酸糖基转移酶具有糖基化藏红花酸形成藏红花素的功能，如2004年Morgan等从藏红花花柱中分离发现UGTCs2基因(GeneID：AY36026)，其原核表达的粗蛋白具有糖基化藏红花酸形成藏红花素的功能，因此将UGTCs2基因注释为藏红花酸糖基转移酶的编码基因；再如2012年Mai Nagatoshi从栀子细胞中分离发现UGT75L6基因(GeneID：AB555731)和UGT94E5基因(GeneID：555739)，UGT75L6基因原核表达的蛋白粗提物具有顺序糖基化藏红花酸形成藏红花素苷5、藏红花素苷3和藏红花素苷4的功能，UGT94E5基因原核表达的蛋白粗提物具有糖基化藏红花素苷5形成藏红花素苷2和藏红花素苷1的功能，因此，将UGT75L6基因和UGT94E5基因也均注释为藏红花酸糖基转移酶的编码基因。但截至目前，仍无法获得高纯度的藏红花酸糖基转移酶。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是如何制备具有藏红花酸糖基转移酶活性的蛋白质。为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了一种制备蛋白质UGTCs4的方法，所述蛋白质UGTCs4具有藏红花酸糖基转移酶活性。本专利技术所提供的制备蛋白质UGTCs4的方法，可包括如下步骤：培养工程菌，得到所述蛋白质UGTCs4；所述工程菌为将重组表达载体导入宿主菌得到的重组菌；所述重组表达载体为将所述蛋白质UGTCs4的编码基因插入表达载体得到的重组质粒；所述蛋白质UGTCs4可为如下a1)或a2)或a3)或a4)：a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；a2)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；a3)氨基酸序列是序列表中序列4所示的蛋白质；a4)将a1)或a2)或a3)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有藏红花酸糖基转移酶活性的蛋白质。其中，序列表中序列2可由459个氨基酸残基组成；序列表中序列4可由492个
氨基酸残基组成。为了使a1)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1、标签的序列标签残基序列Poly-Arg5-6(通常为5个)RRRRRFLAG8DYKDDDDKStrep-tag II8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述a4)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。上述a4)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述a4)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列1或序列表中序列3所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。上述方法中，所述蛋白质UGTCs4的编码基因具体可为如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的DNA分子：b1)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；b2)核苷酸序列是序列表中序列3所示的DNA分子；b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1中所述蛋白质UGTCs4的DNA分子；b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述蛋白质UGTCs4的DNA分子。其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。其中，序列表中序列1由1377个核苷酸组成，序列表中序列1的核苷酸编码序列表中序列2所示的氨基酸序列；序列表中序列3由1476个核苷酸组成，序列表中序列3的核苷酸编码序列表中序列4所示的氨基酸序列。本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本专利技术的编码所述蛋白质UGTCs4的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本专利技术分离得到的所述蛋白质UGTCs4的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述蛋白质UGTCs4，均是衍生于本专利技术的核苷酸序列并且等同于本
专利技术的序列。这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本专利技术的编码序列表的序列2或序列表的序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。上述方法中，所述重组表达载体可为在表达载体的多克隆位点插入序列表的序列1所示的DNA分子得到的重组质粒。所述表达载体可为载体pET-28a(+)。上述方法中，所述重组表达载体具体可为在载体pET-28a(+)的Nde Ⅰ识别位点和Sal Ⅰ识别位点之间插入序列表的序列1所示的DNA分子得到的重组质粒pET28a-UGTCs4。重组质粒pET28a-UGTCs4表达序列表的序列4所示的蛋白质。上述方法中，所述宿主菌可为大肠杆菌。所述大肠杆菌可为大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。上述方法中，所述“培养工程菌”的过程中，进行IPTG诱导。上述方法中，所述“IPTG诱导”的方法如下：当培养体系的OD600nm值为0.3～0.4时，加入IPTG并使其在培养体系中的浓度为50μM～600μM(如50μM、100μM、200μM、300μM、400μM、500μM、600μM、50μM～100μM、50μM～200μM、50μM～300μM、50μM～400μM、50μM～500μM、50μM～600μM、100μM～200μM、100μM～300μM、100μM～400μM、100μM～500μM、100μM～600μM、200μM～300μM、200μM～400μM、200μM～500μM、200μM～600μM、300μM～400μM、300μM～500μM、300μM～600μM、400μM～500μM、400μM～600μM或500μM～600μM)。所述“加入IPTG并使其在培养体系中的浓度为50μM～600μM”指的是所述IPTG在培养体系中的初始浓度。上述方法中，所述“培养工程菌”可包括如下步骤：(1)在18℃～20℃(如18℃或20℃)条件下进行培养，直至培养体系的OD600nm值为0.3～0.4；(2)完成步骤(1)后，加入IPTG并使其在培养体系中的浓度为50μM～600μM，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备蛋白质UGTCs4的方法，包括如下步骤：培养工程菌，得到所述蛋白质UGTCs4；所述工程菌为将重组表达载体导入宿主菌得到的重组菌；所述重组表达载体为将所述蛋白质UGTCs4的编码基因插入表达载体得到的重组质粒；所述蛋白质UGTCs4为如下a1)或a2)或a3)或a4)：a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；a2)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；a3)氨基酸序列是序列表中序列4所示的蛋白质；a4)将a1)或a2)或a3)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有藏红花酸糖基转移酶活性的蛋白质。

【技术特征摘要】
1.一种制备蛋白质UGTCs4的方法，包括如下步骤：培养工程菌，得到所述蛋白质UGTCs4；所述工程菌为将重组表达载体导入宿主菌得到的重组菌；所述重组表达载体为将所述蛋白质UGTCs4的编码基因插入表达载体得到的重组质粒；所述蛋白质UGTCs4为如下a1)或a2)或a3)或a4)：a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；a2)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；a3)氨基酸序列是序列表中序列4所示的蛋白质；a4)将a1)或a2)或a3)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有藏红花酸糖基转移酶活性的蛋白质。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述蛋白质UGTCs4的编码基因为如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的DNA分子：b1)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；b2)核苷酸序列是序列表中序列3所示的DNA分子；b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1中所述蛋白质UGTCs4的DNA分子；b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述蛋白质UGTCs4的DNA分子。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述重组表达载体为在表达载体的多克隆位点插入序列表的序列1所示的DNA分子得到的重组质粒...

【专利技术属性】
技术研发人员：赖成霞，王玮，石必显，李春平，刘忠山，李金枫，
申请(专利权)人：新疆农业科学院经济作物研究所，
类型：发明
国别省市：新疆;65