用于纯化蛋白质的方法和试剂技术

本公开提供用于使用色谱法纯化蛋白质如DNA酶的组合物和方法。所述方法包括单一色谱步骤和使用高浓度盐缓冲液。本公开提供用于从样品纯化蛋白质的方法，所述方法包括将所述样品负载至色谱柱上并且用至少一种具有极高电导率的缓冲液洗涤所述柱。在一些实施方案中，所述洗涤缓冲液具有约50mS/cm、约60mS/cm、约70mS/cm、约80mS/cm或更高的电导率。在其他实施方案中，在用所述极高电导率缓冲液洗涤之后用洗脱缓冲液从所述柱洗脱所述蛋白质。

Method and reagent for purifying proteins

The present disclosure provides compositions and methods for purifying proteins, such as DNA enzymes, using chromatography. The method comprises a single chromatographic step and the use of a high concentration salt buffer. The present disclosure provides methods for purifying a protein from a sample comprising loading the sample onto a chromatographic column and washing the column with at least one buffer having an extremely high conductivity. In some embodiments, the washing buffer has an electric conductivity of about 50mS/cm, about 60mS/cm, about 70mS/cm, or about 80mS/cm or higher. In other embodiments, the protein is eluted from the column with elution buffer after washing with the extremely high conductivity buffer.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于纯化蛋白质的方法和试剂相关申请的交叉引用本申请要求2014年6月25日提交的美国临时申请号62,017,153的优先权，所述临时申请特此出于所有目的以引用的方式整体并入。背景适用于研究和商业用途的蛋白质，包括酶，如脱氧核糖核酸酶(DNA酶)可使用重组方法来产生或从天然产生其的细胞来纯化。在任一种情况下，此类蛋白质的纯化是产生适合于使用的蛋白质的重要步骤。DNA酶和其他蛋白质通常使用色谱法来纯化，包括涉及使用多于一个色谱柱的方法。然而，本领域中存在对于便利且提供高纯度和高产率的用于纯化酶(如DNA酶)的方法的明确未满足的需要。专利技术概述本公开提供用于从样品纯化蛋白质的方法，所述方法包括将所述样品负载至色谱柱上并且用至少一种具有极高电导率的缓冲液洗涤所述柱。在一些实施方案中，洗涤缓冲液具有约50mS/cm、约60mS/cm、约70mS/cm、约80mS/cm或更高的电导率。在其他实施方案中，在用极高电导率缓冲液洗涤后用洗脱缓冲液从柱洗脱蛋白质。在其他实施方案中，洗脱缓冲液也具有极高电导率。在其他实施方案中，洗脱缓冲液具有约50mS/cm、约60mS/cm、约70mS/cm、约80mS/cm或更高的电导率。在一些实施方案中，具有极高电导率的洗涤缓冲液包含选自由(NH4)2SO4、Na2SO4和CH3COONa组成的组的盐。在其他实施方案中，洗涤缓冲液包含0.8M(NH4)2SO4。在一些实施方案中，洗脱缓冲液包含选自由NaCl、KCl和NaOAc组成的组的盐。在其他实施方案中，洗脱缓冲液包含1MNaCl。在一些实施方案中，所述方法包括至少两个洗涤步骤。在其他实施方案中，所述方法包括第一洗涤步骤，其中用具有低电导率的缓冲液洗涤柱。在其他实施方案中，具有低电导率的缓冲液具有约2mS/cm或约1mS/cm的电导率。在此类实施方案中，第二洗涤步骤包括用极高电导率缓冲液洗涤柱。在一些实施方案中，所述方法包括三个洗涤步骤，其包括(i)用具有低电导率的第一缓冲液洗涤柱；(ii)用具有极高电导率的第二缓冲液洗涤柱；以及(iii)用具有低电导率的第三缓冲液洗涤柱。在一些实施方案中，第一洗涤步骤和第三洗涤步骤使用相同的缓冲液。在一些实施方案中，缓冲液中的一种或多种包含CaCl2。在其他实施方案中，缓冲液包含1mMCaCl2。在一些实施方案中，目标蛋白质是任何蛋白质。在其他实施方案中，蛋白质是由细胞产生的任何蛋白质。细胞可天然产生蛋白质，或细胞可进行遗传转变以表达目标蛋白质。因此，在一些实施方案中，从细胞培养物收获样品且负载至柱上。在一些实施方案中，蛋白质是酶，如DNA酶或RNA酶。在具体实施方案中，蛋白质是重组DNA酶。在一些实施方案中，色谱柱是离子交换柱，如阴离子交换柱或阳离子交换柱。在一些实施方案中，色谱柱是混合模式的色谱柱，例如混合模式的色谱柱是多模式阴离子交换器，如CaptoAdhere柱。在一些实施方案中，负载至色谱柱上的样品具有介于约5.0与约9.0之间或介于约6.0与约8.0之间的pH。在一些实施方案中，负载样品的pH是约7.0。在一些实施方案中，负载样品的pH与样品中蛋白质的pI大致相同。在其他实施方案中，负载样品的pH高于蛋白质的pI。例如，在一些实施方案中，pH介于约5.0与约9.0之间并且目标蛋白质的pI是约2.5至约4.5。在具体实施方案中，蛋白质是DNA酶并且负载样品的pH介于约5.0与约9.0之间。在一些实施方案中，高电导率洗涤缓冲液、低电导率洗涤缓冲液和/或洗脱缓冲液的pH介于约5.0与约9.0之间。在其他实施方案中，高电导率洗涤缓冲液、低电导率洗涤缓冲液和/或洗脱缓冲液的pH介于约6.0与约8.0之间。在其他实施方案中，高电导率洗涤缓冲液、低电导率洗涤缓冲液和/或洗脱缓冲液的pH是约7.0。一方面，本公开提供用于从样品纯化蛋白质的方法，所述方法包括在将所述样品负载至色谱柱上之前向所述样品中添加清洁剂。清洁剂可选自由TritonX-100、十二烷基硫酸钠(SDS)、十四烷基硫酸钠、十六烷基硫酸钠、脱氧胆酸钠、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯和NP40组成的组。在一些实施方案中，清洁剂是TritonX-100，并且样品中清洁剂的最终浓度是约0.1％至约1％或约0.5％。在一些实施方案中，本文提供的方法还包括使用本领域中已知的方法，如SDS-Page分析来评估蛋白质的纯度。一方面，本公开提供用于从细胞培养物样品纯化DNA酶的方法，所述方法包括(i)从表达DNA酶的细胞收集收获的细胞培养物流体(HCCF)，(ii)向所述HCCF样品中添加清洁剂，(iii)将所述样品负载至混合模式的色谱柱上，(iv)用包含1mMCaCl2的第一洗涤缓冲液洗涤所述柱，(v)用包含0.8M(NH4)2SO4和1mMCaCl2的第二洗涤缓冲液洗涤所述柱，以及(vi)用包含1.0MNaCl和1mMCaCl2的洗脱缓冲液从所述柱洗脱所述DNA酶。在其他实施方案中，所述方法在步骤(v)与(vi)之间还包括第三洗涤步骤，所述第三洗涤步骤包括用包含1mMCaCl2的洗涤缓冲液洗涤柱。在一些实施方案中，本公开提供一种试剂组合或一种试剂盒。在一些实施方案中，试剂组合或试剂盒包括如本文所述的极高电导率洗涤缓冲液。在一些实施方案中，试剂组合或试剂盒包括如本文所述的极高电导率洗涤缓冲液和极高电导率洗脱缓冲液。在其他实施方案中，试剂组合或试剂盒包括具有约80mS/cm或更高电导率的洗涤缓冲液和具有约80mS/cm或更高电导率的洗脱缓冲液。在其他实施方案中，洗涤缓冲液包含约0.8M(NH4)2SO4，并且洗脱缓冲液包含约1MNaCl。在其他实施方案中，洗涤缓冲液和洗脱缓冲液各自包含1mMCaCl2。附图简述图1是示出从HCCF样品纯化DNA酶的色谱图。图2示出来自DNA酶纯化实验的各种洗脱份的SDS-PAGE分析的结果。泳道1是标记物泳道。泳道2示出未结合的杂质(未与柱结合的杂质)。泳道3示出通过第二次洗涤从柱洗除的结合杂质。泳道4示出洗脱的DNA酶。专利技术详述一方面，本公开提供用于从样品纯化蛋白质的色谱方法。出人意料地，本专利技术人发现可使用高浓度盐缓冲液经由色谱来纯化蛋白质。在一些实施方案中，本公开提供可通过直接将样品负载至色谱柱上来从样品纯化蛋白质。在其他实施方案中，负载之后使用高浓度盐缓冲液进行洗涤和/或洗脱步骤。因此，在一些实施方案中，本文提供的方法有利地允许在无需显著改变含有蛋白质的样品的特征或组分和/或在最小程度上调整色谱柱的情况下从样品纯化蛋白质。例如，本文提供的方法允许在无需改变负载样品的电导率、pH或其他特征且无需对含有蛋白质的样品进行超滤、渗滤或稀释的情况下从样品纯化蛋白质。在一些实施方案中，本专利技术提供通过使用一种或多种具有极高电导率的高浓度盐缓冲液的色谱来纯化蛋白质的方法。在一些实施方案中，所述方法包括至少两个洗涤步骤，一个步骤用于移除未结合的杂质，另一步骤用于移除结合的杂质。在其他实施方案中，所述方法包括第一洗涤步骤，其使用具有低电导率的高盐缓冲液以移除未结合的杂质；第二洗涤步骤，其使用具有极高电导率的高盐缓冲液以移除结合的杂质而不洗脱目标蛋白质；以及洗脱步骤，其使用具有高电导率的高盐缓冲液以从柱洗脱产物。在一些实施本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于从样品纯化蛋白质的方法，所述方法包括：将所述样品负载至色谱柱上，用洗涤缓冲液洗涤所述柱，其中所述洗涤缓冲液具有80mS/cm或更高的电导率，以及用洗脱缓冲液从所述柱洗脱所述蛋白质。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.06.25 US 62/017,1531.一种用于从样品纯化蛋白质的方法，所述方法包括：将所述样品负载至色谱柱上，用洗涤缓冲液洗涤所述柱，其中所述洗涤缓冲液具有80mS/cm或更高的电导率，以及用洗脱缓冲液从所述柱洗脱所述蛋白质。2.如权利要求1所述的方法，其中所述洗涤缓冲液包含选自由(NH4)2SO4、Na2SO4和CH3COONa组成的组的盐。3.如权利要求2所述的方法，其中所述洗涤缓冲液包含约0.8M(NH4)2SO4的浓度。4.如权利要求1所述的方法，其中所述洗脱缓冲液具有80mS/cm或更高的电导率。5.如权利要求1所述的方法，其中所述洗脱缓冲液包含选自由NaCl、KCl和NaOAc组成的组的盐。6.如权利要求5所述的方法，其中所述洗脱缓冲液包含约1MNaCl的浓度。7.如权利要求1所述的方法，其中所述方法包括至少两个洗涤步骤。8.如权利要求7所述的方法，其中第一洗涤步骤包括用具有2mS/cm或更小电导率的缓冲液洗涤所述柱。9.如权利要求8所述的方法，其进一步包括第三洗涤步骤，其中所述第三洗涤步骤包括用具有2mS/cm或更小电导率的缓冲液洗涤所述柱。10.如权利要求1所述的方法，其中所述蛋白质是酶。11.如权利要求10所述的方法，其中所述酶是DNA酶或RNA酶。12.如权利要求11所述的方法，其中所述DNA酶是重组DNA酶。13.如权利要求10所述的方法，其中所述酶是DNA酶，并且其中所述方法中使用的所述缓冲液包含CaCl2。14.如权利要求13所述的方法，其中所述方法中使用的所述缓冲液包含1mMCaCl2。15.如权利要求1所述的方法，其中所述色谱柱是离子交换或混合模式的色谱柱。16.如权利要求15所述的方法，其中所述混合模式的柱是多模式阴离子交换器。17.如权利要求16所述的方法，其中所述混合模式的柱是CaptoAdhere柱。18.如权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：G·S·布兰克，林俊良，
申请(专利权)人：喜康生技公司，
类型：发明
国别省市：开曼群岛,KY