使用染料和糊精的蛋白质检测试剂和方法技术

本发明专利技术提供用于检测蛋白质和定量确定蛋白质浓度的试剂、方法和试剂盒。所述试剂包括蛋白质－复合染料，诸如考马斯染料和一种或多种糊精，从而消除由去污剂引起的干扰。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用染料和糊精的蛋白质检测试剂和方法
本专利技术涉及用于检测蛋白质和定量确定蛋白质浓度的试剂、方法和试剂盒。
技术介绍
存在许多用于检测蛋白质和确定溶液蛋白质浓度的方法。这些包括本领域中熟知的染料-结合方法，并包括非特异性反应，在该反应中，蛋白质-复合染料与蛋白质结合。染料-蛋白质复合物的形成导致染料光学性质的改变，以致存在着与样品中存在的蛋白质的量成比例的颜色变化。用于体外蛋白质量化的蛋白质-复合染料包括溴甲酚绿(Gindler，美国专利号3,884,637)、HABA和甲基橙，但是由于它们几乎排他地结合于白蛋白并通常不是非常灵敏，所以具有局限的应用。其他确定蛋白质浓度的方法包括缩二脲(Biuret)方法(Mokrasch和McGilvery，生物学和化学杂志(J.Biol.Chem.)(1956).221，第909页)，其中含有至少两个肽键的肽结构与碱性溶液中的Cu2+反应，从而形成紫色螯合物。Lowry等(实验室临床医学杂志(J.Lab.Clin.Med.)(1951).39,663)使用了利用碱性铜溶液的蛋白质预处理，类似于缩二脲方法，随后添加福林-西奥卡特(Folin-Ciocalteu)试剂(其含有磷钨酸和磷钼酸的锂盐)。产生的颜色是由Cu-蛋白络合物和由该蛋白质的色氨酸和酪氨酸将磷钨酸和磷钼酸还原为钨和钼蓝的结果。缩二脲和Lowry方法的严重缺点是它们不能耐受蛋白质样品中经常存在的还原剂。已经描述了利用考马斯亮蓝G-250作为蛋白质-复合染料形成染料/蛋白质复合物(Bradford美国专利号4,023,933)。考马斯亮蓝染料与广泛多样的蛋白质结合。而且，使用处于适当的酸性介质中的G-250导致这样的蛋白质测定试剂，所述蛋白质测定试剂具有是缩二脲和常规染料结合技术的大约100倍，是Lowry方法的大约3-5倍的灵敏度(Bradford美国专利号4,023,933)。在美国4,023,933中公开的程序中使用考马斯亮蓝G-250，即＂Bradford测定＂，具有许多超越使用其他染料方法的优点，包括高灵敏度，这允许了当样品中存在还原剂时，使用小样品尺寸和效用。考马斯亮蓝G-250以两种不同的颜色形式，即红色和蓝色存在。该染料的蓝色形式出现在中性和碱性溶液中，而红色形式出现在明显酸性的溶液(pH0-1)中。在酸性溶液中，考马斯亮蓝G-250处于红色和蓝色形式的平衡状态；这样的溶液在外表上呈褐色。认为当蛋白质与染料结合时，染料被引入不同的微环境中，并且然后受到保护以免遭遇为该染料提供红颜色的酸性介质。酸性介质的强度对于利用考马斯染料的蛋白质测定的灵敏度很重要，因为酸性介质强度的增高导致该测定灵敏度的显著降低。蛋白质-染料复合物倾向于聚集，这影响颜色产物的稳定性。增溶剂，诸如乙醇的存在倾向于在合理的时期内保持蛋白质-染料复合物不聚集；然而，太多的乙醇导致向该染料蓝色形式的显著偏移，即将环境改变为较小极性的。假定该测定的机制是染料碳负离子与蛋白质较小极性环境的结合。这可能也解释了大量去污剂和丙酮对该测定的负作用，因为这些化合物通常是天然非-极性的，且应该倾向于改变该染料的环境。Bradford测定的主要缺点是显著缺乏在延长时期内的颜色稳定性，这主要归因于蛋白质-染料复合物的沉淀；基本不显示出对不同蛋白质相同的反应性；不服从Beer法则；和最重要地，样品中存在的去污剂对该测定的不利作用(Bradford，M.，分析生物化学(Anal.Biochem.)，72248-254，1976和美国专利号4,023,933)。染料/蛋白质复合物的形成还用于对凝胶中的蛋白质，诸如电泳中使用的那些进行染色。例如，如此使用了处于高氯酸溶液中的染料考马斯亮蓝G-250(Reisner，A.H.等(1975)分析生物化学(Anal.Biochem.)64,509-516)。目前，许多商业上的、以考马斯为基础的制剂可以用于在电泳分离后对凝胶中的蛋白质进行染色。对于许多电泳应用，使用去污剂诸如SDS促进蛋白质的分离。因为去污剂不利地影响由于考马斯染料与蛋白质结合引起的颜色改变，所以必须通过若干清洗程序去除去污剂，这导致冗长和复杂的染色程序。因此，基于染料的蛋白质检测和量化，特别是利用Lowry测定试剂或考马斯染料的主要缺陷是来自去污剂、表面活性剂和其他两亲性分子的干扰。因此，存在着对这样的检测和定量确定蛋白质的试剂和方法的需要，所述试剂和方法对样品中存在去污剂具有提高的耐受性，并具有提高的蛋白质-染料颜色稳定性。
技术实现思路
本专利技术提供用于检测蛋白质的试剂，其包括或由下列各项组成：(a)蛋白质-复合染料，和(b)一种或多种糊精。所述蛋白质-复合染料是这样的染料，其典型地由于形成蛋白质-染料复合物而经历光学性质的变化，这可以是如使用考马斯TM亮蓝染料、溴甲酚绿、HABA、甲基橙、缩二脲试剂、具有福林-西奥卡特试剂的缩二脲试剂(Lowry试剂)出现的吸收光谱中的变化；或如对形成荧光蛋白/染料复合物的染料，例如考马斯橙TM、荧光素、Alexofluor、藻红蛋白、德克萨斯红TM(TexasRedTM)出现的发射光谱中的变化。优选地，所述蛋白质-复合染料不包括蛋白质，优选地，所述蛋白质-复合染料不包括抗体或肽。所述蛋白质-复合染料优选地是考马斯染料，诸如考马斯亮蓝染料，例如考马斯亮蓝染料G-250或考马斯亮蓝染料R-250。对于一些蛋白质复合染料，且特别是考马斯染料，需要低pH，从而在蛋白质/染料复合物的形成时获得光学性质的必要变化。因此，本专利技术还提供用于检测蛋白质的试剂，其包括：(a)蛋白质-复合染料，(b)一种或多种糊精，和，(c)具有4或更低pKa的酸。在所述试剂中，优选地，所述染料以约0.001％-约0.1％(w/v)，优选地约0.005％-0.05％(w/v)范围内的浓度存在。在使用中，可以稀释所述试剂，典型地，试剂与稀释剂，例如包含蛋白质的溶液的比例应该处于约1:1-约1:60的范围内。为了检测含有25μg/ml或更少蛋白质的溶液中的蛋白质，可以使用1：1的试剂与包含蛋白质的溶液的体积比例。对于具有更高蛋白质浓度的溶液，例如，0.1mg/ml-2mg/ml，试剂与包含蛋白质的溶液的体积比1：60应该是合适的。有用的酸具有处于0-4范围内，优选地3或更低的pKa，以致所述试剂具有-1到1的pH；更优选地，所述酸应该具有处于约1-约3范围内的pKa，以致所述试剂具有0-1的pH。在Bradford专利(US4,023,933)和Gindler专利(US4,239,495)中确定了许多有用的酸，合适的酸包括磷酸、亚磷酸(膦酸)、高碘酸、硒酸、马来酸、草酸和二氯乙酸。磷酸和膦酸是优选的。优选的膦酸是次氨基三(亚甲基)三膦酸(Nitrilotris(methylene)triphosphonicacid，NTP)，其为一种可商购的多元酸。在按照本专利技术的试剂中，当酸存在时，通常以约4％-约20％，优选地，约4％-约12％，优选地，约7.5％-约9.5％(w/v)的浓度存在。在使用中可以稀释所述试剂，这样酸的最终浓度在约2％-约20％的范围内。所述酸可以是多元和一元酸的混合物，在所述混合物中，优选地，多元与一元酸的比在约2：1-本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于检测蛋白质的试剂，所述试剂包括：　（ａ）蛋白质－复合染料，和，　（ｂ）一种或多种糊精。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】GB 2006-4-28 0608377.81.一种检测和/或量化蛋白质的方法，所述方法包括使蛋白质与包括下列各项的溶液相接触：(a)蛋白质-复合染料，和(b)一种或多种糊精，以及检测和/或量化染料/蛋白质复合物的形成，其中待检测或量化的蛋白质已经与去污剂或表面活性剂接触，并且其中一种或多种糊精的浓度为1-100mg/ml。2.按照权利要求1的方法，其中所述蛋白质在去污剂的存在下存在。3.按照权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述蛋白质在溶液中或所述蛋白质被提供在支持体上。4.按照权利要求3所述的方法，其中所述支持体是凝胶、溶胶、层析平板、滤纸、硝化纤维膜或树脂。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述凝胶是聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶。6.按照权利要求5所述的方法，其中所述聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶和所述蛋白质已经利用电场进行了分离。7.按照权利要求3所述的方法，其中所述支持体包含去污剂，和/或其中在去污剂存在的条件下进行接触。8.按照权利要求1所述的方法，其中检测和/或量化包括检测所述染料/蛋白质复合物吸收或发射光谱的变化。9.按照权利要求1所述的方法，其中检测和/或量化包括检测颜色变化，所述检测颜色变化通过采用分光光度法测量在400至700nm范围内的波长处的吸光度而进行。10.按照权利要求9所述的方法，其中所述蛋白质-复合染料是考马斯亮蓝G-250，并在595nm波长处测量吸光度。11.按照权利要求1所述的方法，其中通过随着时间测量吸光度进行量化。12.按照权利要求8至11中任一项的方法，其中将测量到的吸光度或发射量与标准数值、标准数值组、或标准曲线进行比较。13.按照权利要求1的方法，其中所述方法还包括：在所述接触步骤之前，提供包括蛋白质的支持体。14.一种或多种糊精用于降低一种去污剂在蛋白质检测和/或量化方法中的干扰的应用，其中所述一种或多种糊精的浓度为1-100mg/ml。15.按照权利要求14所述的应用，其中所述糊精以包含蛋白质-复合染料和一种或多种糊精的试剂形式提供。16.按照权利要求15所述的应用，其中所述试剂是试剂浓缩物。17.按照权利要求15所述的应用，其中所述试剂还包含具有4或更低pKa的酸。18.按照权利要求15所述的应用，其中所述试剂还包含增溶剂。19.按照权利要求15所述的应用，其中所述蛋白质-复合染料不包含蛋白质。20.按照权利要求15所述的应用，其中所述染料是考马斯亮蓝染料G-250。21.按照权利要求15所述的应用，所述染料以0.001％-0.1％(w/v)范围内的浓度存在。22.按照权利要求15所述的应用，所述试剂被稀释，其中试剂与稀释剂的比率在1∶1至1∶60的范围内。23.按照权利要求15所述的应用，所述应用包括4以下pKa的酸。24.按照权利要求23所述的应用，其中所述酸是选自下列各项中的酸：磷酸、膦酸、高碘酸、硒酸、马来酸、草酸、二氯乙酸和次氨基三(亚甲基)三膦酸，并且其中所述酸以4％-20％(w/v)的浓度存在。25.按照权利要求15所述的应用，其中所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：丹尼尔布莱恩琼斯，海基兰科里特，
申请(专利权)人：伊克斯派德恩有限公司，
类型：发明
国别省市：GB[英国]