利用反应性染料选择性染色水溶性蛋白质的方法技术

本发明专利技术使用纺织工业用的反应性染料，来染色包括抗体在内的各种水溶性蛋白质。染料分子分别结合在组成蛋白质的氨基酸分子的羟基、氨基或硫醇基上。当染色对象是抗体时，被控制在酸性环境，以利于染料分子与抗体组成氨基酸或抗体分子恒定区低醣类碳水化合物上的羟基作用。在免疫分析中，当不需要用抗体来做标示配体时，在微碱性溶液中染色，蛋白质可染有较深色度。蛋白质经活性染料染色后，未完全反应的染料分子，必须分离去除方能使用。纯化后各种颜色蛋白质稳定性很高，并可以通过真空冷冻干燥进一步提高其储存性。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种蛋白质染色的方法，且特别涉及一种。各种免疫分析法在临床诊断、食品品管、污染防治及科学研究各领域，应用越来越广泛。但无论那一类型免疫分析法，都必须把蛋白质标示起来，做为分析过程中的计量用途。如被测物Z是抗原Ag，或是抗体Ab，则可根据抗原、抗体的价格及取得的难易程度等因素，有如附图说明图1举例(1)及(2)的分析逻辑设计。此时，Ab1和Ab2为抗被测物Z的两种不同性质的抗体，L即是所谓标示配体(marker ligand)。当L是放射性元素时，这种方法被称为放射免疫分析法；当L是酶时，称为酶免疫分析法；L是萤光物或化学冷光物时，称为萤光免疫分析法及冷光免疫分析法。总之，随着L的不同，免疫分析法有不同的计量方式，而冠之有不同名称。以上这四种方法是现阶段实用免疫分析法的主流。五十年代放射免疫分析法实用化以来，对人类社会有重大贡献，灵敏又便宜，但是操作者的安全性顾虑及废弃物处理，限制了它的发展。七十年代专利技术的酶免疫分析法，顺利的取代了放射免疫分析法大部分市场。酶免疫分析法的缺点在于稳定性及灵敏性较差，培育时间长。萤光免疫分析法好处是灵敏度高，进一步取代了一些放射免疫分析的应用，缺点是仪器设备配合问题，使得临床检验这种使用频繁的应用领域，不易借以做日常化验。化学冷光免疫分析法的好处与萤光免疫分析法相同，但一旦改装为高速度、自动化免疫分析仪器，不免变得体积庞大及价格昂贵，并不利于免疫分析在民生福利社会的推广应用。在八十年代，有人用扩散性染料，做成200～300纳米(nanometer)微粒来吸附抗体，发展出所谓的染料免疫分析法(dye immunoassay，DIA)。此方法因微粒大小、形状及分布控制较困难、不同抗体对同样扩散性染料有不同吸附能力、不同扩散性染料对同一蛋白质又有不同吸附反应等工艺因素，外加吸附抗体的染料微粒稳定性较差等产品因素，而一直未得以实用。反应性染料(reactive dye)又称为活性染料(active dye)，1956年推出，设计目的为通过共价键结合方式，将染料分子接合在绵纤维的羟基上。基本上分为(1)亲核性取代反应(substitution)，染料如三氮六环苯(triazine)反应性染料系列及(2)亲核性加成反应(addition)，染料如乙烯基砜(vinyl sulfone)系列两大类。虽然原设计为染色棉纱，但因以上两种亲核性反应(nucleophilic reaction)，又可以与氨基及硫醇基作用，所以多年来又常用之于羊毛及蚕丝的染色。反应性染料一般在绵纱、羊毛及蚕丝材料的染色时，一般均采取pH值10.5以上，反应温度在60～100℃间，同时加上大量盐类。目的如下(1)促使各种纺织材料膨胀，易使着色均匀；(2)加快染色速度；(3)染料着色率高、废料少、符合环保要求；(4)在碱性环境中，羟基、硫醇基游离化，而氨基被中和，氨基酸中上述各官能团的未配对电子对(lone paired electron)的负电性均大为增加，而有利于对染料分子的亲核性反应。因此本专利技术的主要目的就是在于提供一种。当其应用在免疫分析上时具有安全、反应时间短、制作简便、经济而灵敏的优点。本专利技术的目的是这样实现的，反应性染料的染料分子分别结合在组成蛋白质的氨基酸分子的羟基、氨基或硫醇基上。当染色对象是抗体时，被控制在酸性环境，以利于染料分子与抗体组成氨基酸或抗体分子恒定区低醣类碳水化合物上的羟基作用。在免疫分析中，当不需要用抗体来做标示配体时，在微碱性溶液中染色，蛋白质可染有较深色度。蛋白质经活性染料染色后，分离未完全反应的染料分子，纯化后各种颜色蛋白质稳定性很高。为使本专利技术的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举一较佳实施例，并配合附图，作详细说明图面说明图1是一非均质式免疫分析法示意图；图2是经反应性染料procion red MX-8R染色的肌红蛋白抗体与肌红蛋白在琼脂基板上产生的沉淀线图；图3是经amino black染色及脱色的肌红蛋白抗体与肌红蛋白在琼脂基板上产生的沉淀线图；图4是牛血清白蛋白经procion red MX-8R染色后的可见光图谱；图5是未经染色的牛血清白蛋白可见光图谱，其浓度是7.8mg/ml。本抗体染色及其在免疫分析应用上的专利技术，在于使用纺织工业用的反应性染料，如与被染色物进行亲核性取代反应的三氮六环苯系列，以及与被染色物进行亲核性加成反应的乙烯基砜系列。以控制酸碱度的方式，使反应集中在抗体蛋白质及共轭其上的低聚糖的羟基上，而使染色抗体维持其原有力价及免疫性质。染色反应后的蛋白质，经分离纯化，去除未反应染料，可以用在免疫分析中的各种用途，成为一种创新性的染料免疫分析法，可以称为溶解性染料分析法(solubledye immunoassay，SDIA)。与放射免疫分析法相比较，有安全便利的好处；比酶免疫分析法灵敏、快速、稳定；更比萤光或冷光免疫分析法有使用便利及成本低廉的优点。水溶性蛋白质反应性染料染色，举肌红蛋白(myoglobin)及牛血清白蛋白为例，依下列条件进行(一)肌红蛋白抗体染色反应。10毫克兔子抗人肌红蛋白抗体溶于pH4.8、0.01M的醋酸钠盐缓冲溶液中，加入5毫克procion red MX-8R，在冰浴温度避光搅拌反应廿四小时后，注入一1.1×30厘米的Sephadex G-25管柱，以pH6.8、0.05M磷酸盐缓冲液，每小时20毫升速度冲流，并用分级收集器，每管收集一毫升。经共价键染色肌红蛋白抗体，因体积大，不进入Sephadex G-25分子筛胶粒的孔隙，不被吸附，因此流出较快；未反应及凝结(aggregate)的染料分子，则因被吸附进入胶粒中孔隙而较慢流出。先冲出的红色各管经集中冷冻干燥后保存，供进一步实验使用。(二)肌红蛋白抗体免疫力价测定。1％琼脂配制于巴比妥(barbital)(pH8.2，0.05M)缓冲液中，在50℃溶解，配制Ouchterlony双向免疫扩散薄板。取染色的抗体1.32毫克/毫升做成2、4、8、16、32、64、128、256、512、1024、2048、4096等倍数的稀释液。未经染色抗体取同样浓度，稀释亦同，做对比实验。取15微升2.1毫克/毫升的人肌红蛋白，放置于配制好的Ouchterlony琼脂板的中间孔洞，另各取15微升不同稀释倍数染色及未染色的肌红蛋白抗体分别注入琼脂板中间孔洞的外围孔洞，加盖，室温静置六小时。观察发现在2至64倍稀释的染色肌红蛋白抗体与中心肌红蛋白之间产生红色沉淀线。而未染色抗体仅在2至16倍稀释与抗原有混浊沉淀线。再经静置六小时，染色抗体与抗原的红色沉淀线并未增加(见图2)。未染色抗体双向扩散琼脂平皿上，经用氨基黑(Amido black)染色及脱色，在2至64倍稀释未染色抗体与抗原间，亦染出沉淀线，参见图3。本实验说明，肌红蛋白抗体经在pH4.8环境中与反应性染料作用后，不但仍保持其活性，其力价与未染色抗体相比，并未产生改变。(三)反应性染料在抗体上共价键结合位置。a.神经胺酶(neuramidase)的前处理。购入的神经胺酶经在pH8.0，0.05M醋酸缓冲液4℃透析一夜，再注入一5毫升Sepharose固定的牛胎球蛋白(fetuin)管柱，然后本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种水溶性蛋白质的染色方法，其特征在于：利用一反应性染料让该水溶性蛋白质进行一染色反应，该反应性染料可选自于纺织工业所用的三氮六环苯与乙烯基砜系列反应性染料所组成的族群，而该染色反应是在一酸性或一碱性的环境下进行的，其中当该水溶性蛋白质是一抗体时，该染色反应是在酸性的环境下进行的，使染料分子作用于该抗体蛋白质氨基酸支链的羟基上、结构恒定区与重链部分的羟基上、以及与该抗体共轭的低聚糖的羟基上。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：许宗雄，姚文法，
申请(专利权)人：台湾元生生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：71[中国|台湾]