通过小麦水溶性蛋白鉴定小麦品种的高效毛细管电泳方法技术

本发明专利技术涉及一种小麦品种的快速鉴定方法。该方法包括取样及样品制备、毛细管电泳和数据处理分析，通过建立小麦水溶性蛋白的标准高效毛细管电泳图谱，进而实现对小麦品种或种质进行鉴定，其特征是取单粒种子无胚端，约１５－２０ｍｇ，按１ｍｇ加１０μｌ的比例加入２０％乙醇，室温下震荡提取１５分钟，１００００ｒｐｍ离心１０分钟，上清液即为毛细管电泳样品；高效毛细管电泳时的电泳缓冲液为０．１Ｍ磷酸一甘氨酸缓冲液，该缓冲液ｐＨ为２．５，添加有２０％乙腈和０．０５％羟脯氨酰甲基纤维素，并给出了具体的电泳条件参数以及冲洗程序。相对于现有小麦品种的鉴定方法，该方法具有快速、准确、成本低、可重复性好的特点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种小麦品种的快速鉴定方法，特别是通过高效毛细管电泳手 段快速分离小麦水溶性蛋白并构建标准图谱进而在此基础上实现对小麦品种的 鉴定方法。
技术介绍
小麦是世界上最重要的粮食作物之一，也是人类粮食消费中重要的蛋白质 来源。我国一直是世界小麦生产和消费大国，播种面积和总产都居世界第一位。 作为小麦种子蛋白重要组成部分的水溶性蛋白已受到越来越多的重视，在小麦种子中，水溶性蛋白包括清蛋白(albumin)和球蛋白(globulin),主要是一些代 谢过程中的酶类、抑制因子等，如a-淀粉酶、蛋白酶抑制因子、调控酶、特殊 途径的合成酶、代谢酶等，主要作用是调控小麦的各种代谢过程，对食物的功 能、淀粉的积累、小麦蛋白的级别、最终用途及颗粒的颜色等都具有重要的作 用和影响。清蛋白和球蛋白主要沉积在胚、糊粉层中，少部分存在于胚乳，分 别占种子蛋白的9%和5%左右。也有相关研究证明一些高分子量清蛋白和球蛋白属于小麦贮藏蛋白部分。研究表明，水溶性蛋白可以作为小麦品质和种子发育 研究以及品种鉴定的生化标记。近年来随着我国市场经济的不断发展，在小麦种子生产与经营、新品种选 育和品种权益保护以及流通加工等领域急需快速高效的小麦品种鉴定方法。目 前，鉴定小麦品种主要采用形态鉴定、同工酶鉴定、贮藏蛋白SDS凝胶电泳 (SDS-PAGE)鉴定和酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳(A-PAGE)鉴定、反相高效液相 色谱(RP-HPLC)鉴定、分子标记鉴定等方法。然而上述些方法均存在不同程 度的局限性，如形态特征易受环境因素影响，可靠性差；同工酶、蛋白质电泳 分离时间长，费工费时，多数情况下需要1-2天才能获得分析结果，而且分辨 率低，对一些亲缘关系近的品种往往无法区分，其分辨度和重复性也较差，难 以进行数量化分析和不同实验室所得结果间的比较。另外PAGE方法还须使用 有神经毒性的丙烯酰胺以及其他污染试剂；RP-HPLC虽自动化程度高，但仪器 设备昂贵，分析成本高，分辨率也难以满足需要；DNA分子标记技术，如PCR、 RAPD、 AFLP等，近年来研究较多，准确性较高，但技术复杂，费工费时，鉴定成本高，难以广泛应用。因此，现有的小麦品种鉴定方法都存在一些缺点。相对于"快速鉴定小麦品种的毛细管电泳方法"(CN200410037256.6)专 利技术，本专利技术提供了另外一种对小麦品种进行鉴定的高效毛细管电泳方法， 是通过小麦的水溶性蛋白的分离与鉴别实现的，而不是通过小麦种子贮藏蛋白 中醇溶蛋白的高效分离与鉴别实现的。高效毛细管电泳(High Performance Capillary Electrophoresis, HPCE)是一 种新型分离技术，具有分离效率高、分析速度快等特点，在蛋白质、氨基酸、 核酸等生物大分子的分离分析方面显示了极大的优越性。由于种子水溶性蛋白 组成复杂，异质性高，高效的分离技术是快速分离鉴定的关键。毛细管电泳的 仪器装置主要包括五个部分高压电源、进样系统、毛细管柱、检测器和记录 系统。制作毛细管的材料——熔融硅胶的等电点(pl)为1.5左右，在碱性和微酸性(PH>2.5)溶液中，熔硅表面的硅羟基(Si-OH)电离成SiOVf吏其内表面带 负电。负电荷表面在溶液中积聚相反电荷的离子，在管壁和溶液之间形成双电 层。在高电场的作用下，双电层中的水合阳离子引起的流体整体将朝负极方向 移动，该现象被称为电渗(Electroosmosis)。粒子在毛细管内一方面受到电场作 用而在缓冲溶液中发生定向移动，即电泳；另一方面受到电渗的影响。粒子最 终的迁移速度等于电泳流和电渗流的矢量和。样品中的正离子电泳方向与电渗 流方向一致，故最先流出；中性粒子仅在电渗流的作用下流向负极，速度较正 离子慢；负离子运动方向与电渗相反，在电渗速度大于电泳速度时，将在中性 粒子之后流出，如果负离子泳流速度大于渗流速度，则无法流出。 一般来说， 电渗流速度大于电泳速度，所以样品中所有组分将朝一个方向移动，这样各种 粒子因在毛细管介质中的迁移速度不同实现了分离。影响毛细管电泳分离效果的因素较多，主要包括操作电压、温度、缓冲溶 液的类型与浓度、pH值、添加剂的选择与浓度的确定、毛细管柱的改性等。在 实际应用中，需要针对的具体检测物对这些因素进行优化，以达到最佳分离效 果。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种快速分离小麦种子水溶性蛋白的高效毛细管电泳 方法，给出优化的操作程序和条件，进而通过小麦种子水溶性蛋白的HPCE图 谱实现对小麦品种的鉴定，相对于现有的鉴定方法，该技术具有快速、准确、 成本低、可重复性好的特点。本专利技术的技术方案包括取样及样品制备、毛细管电泳和数据处理分析，通 过建立小麦水溶性蛋白的标准高效毛细管电泳图谱，进而实现对小麦品种或种质进行鉴定，其特征是取单粒种子无胚端(约15-20mg),按lmg加10^il的比 例加入20%乙醇，室温下震荡提取15分钟，10000rpm离心IO分钟，上清液即 为毛细管电泳样品；髙效毛细管电泳时的电泳缓冲液(Buffer)为0.1M磷酸一 甘氨酸缓冲液，该缓冲液pH为2.5，添加有20%乙腈和0.05%羟脯氨酰甲基纤 维素，具体电泳条件参数为毛细管长度31.5cm毛细管内径5(Him运行电压 ll.OkV毛细管温度35 °C样品槽温度15°C进样10kV,6-8秒在上述技术方案中，为了能够连续检测样品和保证检测结果的准确性，在 进行高效毛细管电泳时，对毛细管进行冲洗必须按冲洗程序操作，按照冲洗目的的不同，冲洗程序具体分为以下四种情况(1) 对于新的毛细管在使用前要进行预处理冲洗，冲洗程序如下H20 5分钟O.lMNaOH 10分钟H20 5分钟1MH3P04 10分钟电泳缓冲液 60分钟(2) 进样前对毛细管进行冲洗，冲洗程序如下H20 5分钟O.lMNaOH 10分钟H20 5分钟1MH3P04 10分钟电泳缓冲液 30分钟(3) 当一次鉴定测定多个样品时，两次样品检测之间要进行冲洗，冲洗 程序如下1MH3P04 3分钟电泳缓冲液 3分钟(4) 检测结束后对毛细管进行冲洗，冲洗程序如下1MH3P04 H20O.lMNaOH H205分钟 5分钟 2分钟 15分钟 10分钟本专利技术的优点是(1) 样品用量少只需半粒种子约15-20mg即可进行多次分析。利用本 方法可在10分钟内完成一个样品的分离，效率明显高于常规的PAGE方法。(2) 分辨度高明显高于传统电泳方法，而且图谱稳定。(3) 重复性高峰迁移时间和峰高的相对标准偏差(RSD)分别小于1% 和3%。(4) 易于操作从样品制备到蛋白质分离分析自动化程度高，方法简单， 易于操作。每次可连续分离30个样品，均由软件控制。(5) 分析成本低、无污染只需廉价毛细管和一些常用试剂，用量很少， 无毒害，对环境无污染。图1.普通小麦品种"济麦20"水溶性蛋白高效毛细管电泳标准图谱；图2.郑州9023等7个不同小麦品种水溶性蛋白高效毛细管电泳比较图谱；图3.优质品种(A-藁城8901， B-优选9号和C-中作8331-1)和劣质品种 (D-淮麦16， E-原冬6号和F-鲁麦21)水溶性蛋白的高效毛细管电泳鉴定。具体实施例方式实施例1:小麦品种水溶性蛋白标准H本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种通过小麦水溶性蛋白鉴定小麦品种的高效毛细管电泳方法，包括取样及样品制备、毛细管电泳和数据处理分析，通过建立小麦水溶性蛋白的标准高效毛细管电泳图谱，进而实现对小麦品种或种质进行鉴定，其特征是取单粒种子无胚端，约１５－２０ｍｇ，按１ｍｇ加１０μｌ的比例加入２０％乙醇，室温下震荡提取１５分钟，１００００ｒｐｍ离心１０分钟，上清液即为毛细管电泳样品；高效毛细管电泳时的电泳缓冲液为０．１Ｍ磷酸－甘氨酸缓冲液，该缓冲液ｐＨ为２．５，添加有２０％乙腈和０．０５％羟脯氨酰甲基纤维素，具体电泳条件参数为：　　　　毛细管长度：３１．５ｃｍ　　　　毛细管内径：５０μｍ　　　　运行电压：１１．０ｋＶ　　　　毛细管温度：３５℃　　　　样品槽温度：１５℃　　　　进样：１０ｋＶ，６－８秒。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：晏月明，王爱丽，高利艳，张倩，张艳贞，
申请(专利权)人：首都师范大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]