用于饱和标记蛋白质的荧光染料、方法及试剂盒技术

本发明专利技术提供了一组匹配的荧光染料，其中该组中的每一种染料能够共价连接于蛋白质上，并且其中每一种染料具有彼此互相匹配的分子结构和电荷，这使得利用该组中的一种染料标记的蛋白质的相对电泳淌度与用该组中另一种染料标记的蛋白质的相对电泳淌度相同。该匹配的组含有至少两种不同的通式的荧光染料：其中ｎ是１、２或３；Ｚ１和Ｚ２独立地表示闭合苯基或萘基环系所必需的碳原子；基团Ｒ１和Ｒ２中的一个是目标连接基团；其余的基团Ｒ１或Ｒ２选自－（ＣＨ２）４－Ｗ或－（ＣＨ２）ｒ－Ｈ；基团Ｒ３是氢，除了当Ｒ１或Ｒ２是－（ＣＨ２）ｒ－Ｈ时，Ｒ３是Ｗ的情形之外；Ｗ选自磺酸和磺酸酯。本发明专利技术还提供了一种使用荧光染料饱和标记蛋白质的方法，它使得可以对所有可得到利用的目标氨基酸、适宜的半胱氨酸、蛋白质中的残基进行标记，从而得到被标记蛋白质分子的单一种群。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及荧光染料，以及用于对复合蛋白质样品进行标记的方法，以实现差异蛋白分析。双向差异凝胶电泳(DIGE)在双向(2D)电泳分离之前使用匹配的、可光谱分辨的荧光染料来标记蛋白质样品(Minden，J.等人，Electrophoresis，(1997)，18，2071)。这种荧光多路复用技术克服了传统的双向电泳的很多缺点。对蛋白质样品进行荧光预标记可以允许多个样品在同一凝胶上操作，从而保证通过重叠荧光图象可以方便地识别出这些样品之间的定量差异。为了允许荧光多元化，必须用染料对蛋白质样品进行相同的标记，并且被标记的蛋白质在凝胶中的迁移必须在位置上相匹配，以保证定量差异被检测到。WO 96/33406(Minden，J.等人)公开了一种检测不同的细胞样品之间的差别的方法，它在双向电泳之前使用匹配的、可光谱分辨的染料来标记样品中的蛋白质。为了保证等同的迁移，所述染料在分子量和电荷上是匹配的。该方法使用了具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯反应性基团的花青染料来标记胺类。该NHS酯基靶向蛋白质中的赖氨酸残基的ε-氨基，从而导致共价标记。将三种不同的染料(Cy2TM、Cy3和Cy5)衍生来实现多路传输。这些染料分子具有大约500道尔顿的分子量，并且为了保证被标记的蛋白质等同迁移，它们在质量上是匹配的。这类染料利用花青氟的本征电荷来弥补染料与赖氨酸轭合时赖氨酸的正电荷损失。WO 96/33406描述了这些染料在最小化标记策略中的应用，以便在1-2％的可附着位点之间进行标记。为了实现等同迁移，通过调节通过两个碳单元与吲哚氮相连的脂肪链的大小，来弥补花青吲哚环之间的连接链长度上的差别，使这些染料对在质量上匹配。满足这些标准的两种或多种可光谱分辨的染料代表了匹配的最小化标记染料组。使用丙基Cy3和甲基Cy5标记蛋白质，然后双向分离并将所得到的图象重叠，表明这两种被标记样品在位置上是匹配的，从而证实了该匹配赖氨酸最小化标记染料组是等同迁移的。赖氨酸残基在蛋白质中是非常丰富的，这确保了这种标记策略代表在复合样品中存在的所有蛋白质。然而，蛋白质中通常的赖氨酸含量为7％，并且如果蛋白质中的所有赖氨酸均被标记的话，可能引起因染料导致的大的质量变化。因此，所使用的策略对蛋白质进行“最小化”标记以确保5个蛋白质分子中仅有～1个被标记，从而保证所得到的统计概率为每个被标记的分子仅连接了一种染料。这样得到十分类似于银染图象(silver stained image)的双向斑点图案，但是其赋予了更大的多路复用的灵敏度和动力学范围以及能力。典型的双向凝胶分析包括从凝胶上“采集”感兴趣的蛋白质斑点以通过MALDI-MS进行识别。最小化标记方法中每个蛋白质得到2个斑点(即被标记的和未被标记的)，其中大多数蛋白质是未被标记的斑点。未被标记的斑点必须被定位以回收足够多的蛋白质从而确保证通过MALDI-MS进行鉴定。这要求在斑点采集之前进行附加的着色步骤。为了加快直接从荧光凝胶上采集蛋白质斑点，需要一种能使每种蛋白质得到单一斑点的标记策略。为了标记尽可能多的目标残基以及为了使每种蛋白质异形体得到单一被标记的斑点，本专利技术所使用的标记策略目的是将该蛋白质用染料饱和。因此，将花青染料分子偶合至蛋白质的所有可能利用的目标氨基酸残基上，从而得到被标记蛋白质分子的单一种群，它们连接有数量相当的染料分子。根据本专利技术，使用定向于含有巯基的半胱氨酸残基的颜料组来实现饱和标记。半胱氨酸残基存在于95％的蛋白质中，但是在每种蛋白质中半胱氨酸比赖氨酸少。这意味着所有的蛋白质分子都可以被标记，但是如果将赖氨酸残基标记至饱和，那么每种蛋白质分子将具有更少的被标记残基。这使得检测的灵敏度得到提高，这是因为被标记蛋白质的比例高于使用最小化标记的比例，但是确保了这些蛋白保持可溶性。与使用赖氨酸残基的最小化标记策略相比，使用半胱氨酸残基的饱和标记，由于加入了染料，质量增加更大(质量位移)。然而，如果对赖氨酸残基使用饱和标记手段，那么观察到的质量增加要小。因加入颜料而引起的质量位移的程度视各种蛋白质不同而不同，这取决于单个的蛋白质半胱氨酸的含量(通常是～2％)以及在标记条件下半胱氨酸残基对染料的利用度。这导致双向斑点图案远远不同于先前已经公开的银染双向蛋白质图象。因此，本专利技术提供了一类荧光试剂以及对存在于含半胱氨酸的蛋白质混合物中可接近的所有可能的半胱氨酸残基进行重复标记的方法。根据本专利技术的花青染料衍生物提供了有用的荧光标记组，它们具有共同的核心结构并且尤其可用于多路复用分析。因此，本专利技术第一方面提供了荧光染料的匹配组，它含有至少两种式(I)结构的不同荧光染料 其中对于每一种所述染料，n不同，并且为1、2或3；Z1和Z2独立地表示闭合苯基或萘基环系所必需的碳原子；基团R1和R2中的一个是下列基团 其中Y是目标连接基团；另一个基团R1或R2选自-(CH2)4-W或-(CH2)r-H；基团R3是氢，除了当R1或R2是-(CH2)r-H时，R3是W的情形之外；W选自磺酸和磺酸酯；p是3-6的整数；q选自2或3；以及r是1-5的整数；以及它们的盐类；其特征在于，当所述染料是的两种的n相差+1时，则所述的两种染料的p、q和r中的一个相差-1。本专利技术提供了一种荧光染料的匹配组，其中该组中的每一种染料能够共价连接于蛋白质上，并且其中每一种染料具有彼此互相匹配的分子结构和电荷，这样使得使用该组中的一种染料标记的蛋白质的相对电泳淌度与用该组中另一种染料标记的蛋白质的相对电泳淌度相同或者基本上相同。在根据本专利技术第一方面的一个实施方案中，该染料匹配组含有至少两种不同的荧光染料，其中所述组中的每一种染料为具有式(I)的化合物，其中Z1、Z2、R1、R2、R3、Y、W、n、p、q以及r如上文定义。适宜地，该荧光染料匹配组中的不同染料是光谱可分辨的以保证用这类染料标记的不同样品彼此能够互相区别开来。适宜地，该染料匹配组中的至少两种染料具有根据式(I)的结构，它们可以选自三次甲基花青染料类(其中n＝1)、五次甲基花青染料类(其中n＝2)以及七次甲基花青染料(其中n＝3)。适宜地，根据本专利技术的荧光染料匹配组含有至少两种式(II)的不同荧光染料 其中对于每一种所述的染料，n不同，并且为1、2、或3；基团R1和R2中的一个是下列基团 其中Y是目标连接基团；另一个基团R1或R2选自-(CH2)4-W或-(CH2)r-H；基团R3是氢，除了当R1或R2是-(CH2)r-H时，R3是W的情形之外；W选自磺酸和磺酸酯；p是3-6的整数；q选自2或3；以及r是1-5的整数；以及它们的盐类；其特征在于，当所述的两种染料的n相差+1时，所述的两种染料的p、q和r中的一个相差-1。优选地，该荧光染料匹配组含有至少两种根据式(I)或(II)的不同染料，其中n选自1或2；p选自4或5；q选自2或3；以及r选自1、2或3。优选地，该荧光染料匹配组中的每一种染料的目标连接基团Y是相同的，并且选自马来酰亚胺基(maleimido)和碘代乙酰胺基(iodoacetamido)。每种染料中特别优选的目标连接基团是马来酰亚胺基。特别优选的是选自三次甲基花青类染料和五次甲基花青类染料的式(I)或(II)的染料组。将这类染料描述为Cy3本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种荧光染料的匹配组，它含有至少两种式（Ⅰ）结构的不同荧光染料：＊＊＊（Ⅰ）其中对于每一种所述的染料，ｎ不同，并且为１、２、或３；Ｚ↑［１］和Ｚ↑［２］独立地表示闭合苯基或萘基环系所必需的碳原子；基团Ｒ↑ ［１］和Ｒ↑［２］中的一个是下列基团：－（ＣＨ↓［２］）↓［ｐ］－＊－ＮＨ－（ＣＨ↓［２］）↓［ｑ］－Ｙ其中Ｙ是目标连接基团；另一个基团Ｒ↑［１］或Ｒ↑［２］选自－（ＣＨ↓［２］）↓［４］－Ｗ或－（ＣＨ↓［２］）↓［ ｒ］－Ｈ；基团Ｒ↑［３］是氢，除了当Ｒ↑［１］或Ｒ↑［２］是－（ＣＨ↓［２］）↓［ｒ］－Ｈ时，Ｒ↑［３］是Ｗ的情形之外；Ｗ选自磺酸和磺酸酯；ｐ是３－６的整数；ｑ选自２或３；以及ｒ是１－５的整数；　 　以及它们的盐类；其特征在于，当所述染料中的两种的ｎ相差＋１时，所述的两种染料的ｐ、ｑ和ｒ中的一个相差－１。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：K威廉斯，T斯通，AC辛蒙兹，AC斯维特，SJ福勒，
申请(专利权)人：通用电气医疗集团英国有限公司，
类型：发明
国别省市：GB[英国]