直接核酸扩增试剂盒、试剂和方法技术

本发明专利技术涉及直接核酸扩增试剂盒、试剂和方法。具体而言，本发明专利技术涉及可用于扩增核酸的具有减少用户的时间和可能的污染的优点的组合物、方法和试剂盒。本发明专利技术的干燥的试剂组合物可用来容易地处理和扩增核酸样品。可用来容易地处理和扩增核酸样品。可用来容易地处理和扩增核酸样品。

【技术实现步骤摘要】
直接核酸扩增试剂盒、试剂和方法
[0001]本申请为分案申请，原申请的申请日为2013年10月23日，申请号为201380055445.3(PCT/EP2013/072206)，专利技术名称为“直接核酸扩增试剂盒、试剂和方法”。
专利

[0002]本专利技术涉及核酸扩增的领域，特别是涉及使用聚合酶链反应扩增核酸的用途。为容易地扩增核酸样品，本专利技术提供可用于通过冻干或冷冻
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干燥核酸扩增试剂扩增核酸的方法和试剂盒。本专利技术具有在容易地处理核酸中的应用和在基因分型、诊断和法医方面是特别有用的。
[0003]专利技术背景聚合酶链反应(PCR)是用于分子生物学供扩增核酸的常见工具。US4683202 (Mullis, Cetus Corporation)描述了用于扩增在核酸或其混合物中所含的任何所需特定核酸序列的方法。
[0004]US5705345 (Lundin等人)描述了核酸制备的方法，其中含有细胞的样品被溶胞以释放核酸和样品用环糊精处理以中和萃取剂。这种系统的优点是传统的去垢剂去除需要一个分离步骤；然而加入环糊精以中和去垢剂排除了对分离步骤的需要，因此减少了污染的危险。
[0005]WO9938962 (Health, Gentra Systems Inc.)描述了一种具有结合的溶胞试剂的固体支持体。溶胞试剂可包含去垢剂、螯合剂、水和任选的RNA消化酶。用于PCR扩增的方法需要纯化核酸用于扩增分析的其它步骤。
[0006]WO9102040 (Kosak)描述了在扩增反应混合物中使用环糊精标记的引物用于定性和定量核酸序列分析的专利技术。该专利技术的益处是更高的信号效率和标记颜色的通用性。
[0007]WO9532739 (Agrawal)描述了与环糊精非共价复合的寡核苷酸。然而环糊精与寡核苷酸的结合是用于寡核苷酸的细胞摄取而不用于PCR反应中的核苷酸的扩增。
[0008]WO2010066908 (Beckers等人,)描述了环糊精改进PCR的特异性、灵敏度和/或产率的用途。该方法公开在包含至少一种环糊精的反应混合物中进行的扩增反应且该扩增反应在反应混合物上进行。该PCT申请公开了用于在样品中扩增目标核酸的试剂盒，所述试剂盒在同一容器中包含至少一种环糊精和至少一种选自PCR试剂列表的成分。该申请还公开试剂盒可作为包含几种成分的预混合物提供，其也可以脱水的冻干的形式提供。然而，该申请中没有这样冻干的预混合试剂盒或者甚至此类试剂盒可如何制备的实例。
[0009]用于DNA扩增的当前方法涉及通常包含几个步骤的DNA纯化程序，其增加污染的机会。这是一个繁琐的过程，而现有技术的方法在成本、复杂性和特别是用户的时间方面具有许多明显的缺点。例如，基于柱的核酸纯化是典型的纯化核酸的固相提取方法。这种方法依赖于通过吸附结合于二氧化硅或其它支持体(取决于缓冲液的pH和盐含量)的核酸。合适的缓冲液的实例包括Tris
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EDTA (TE)缓冲液或磷酸盐缓冲液(由于反应性胺而用于DNA微阵列实验)。在这样的离心柱(spin column)上的核酸纯化包括许多复杂和繁琐的步骤。在离心柱上的核酸纯化通常包括3个耗时和复杂的步骤/阶段：
Foods: A Review): A Review. J. Food Engineering 49, 311
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319)。使用空气干燥方法的一些问题是，干燥的产品并不以可容易分散的形式存在。而且，生物试剂在或高于干燥过程的温度下必须是稳定的并且精确控制是一个困难的过程。
[0019]使用冷冻
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干燥技术的一个特化方法是形成液滴或球，其与低温液体接触，然后冷冻干燥。该技术的一个缺点是试剂球是脆弱的且易于崩解。
[0020]用于稳定生物试剂的载体或填充剂的一个类型是形成玻璃的填充材料(US5565318)。将生物试剂溶液掺入形成玻璃的填充材料(其为水溶性的或水溶胀性物质)中。然后将它们干燥以产生一种固定和稳定生物试剂的玻璃状组合物(US5593824)。
[0021]碳水化合物如葡萄糖、蔗糖、麦芽糖或麦芽三糖是一组重要的玻璃形成物质。可使用其它多羟基化合物如碳水化合物衍生物像山梨醇和化学改性的碳水化合物。另一种重要类别的玻璃形成物质是合成的聚合物如聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺或聚乙烯亚胺。
[0022]玻璃形成物质的其它实例包括糖共聚物如Ficoll
TM (US3300474)。Ficoll是一种易溶于水性溶液的中性的、高度支化的、高质量、亲水性多糖。Ficoll的半径范围为2
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7 nm。其通过多糖与表氯醇的反应来制备。Ficoll具有在5,000
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1,000,000之间的分子量并包含通过醚键连接至双官能团的蔗糖残基。这样的基团可以是2、3或更多个碳原子，但通常不超过10个碳原子的亚烷基。双官能团起着将糖残基连接在一起的作用。这些聚合物可，例如，通过糖与卤代醇或双环氧化合物的反应而制得。玻璃通常被定义为具有非常高的粘度的过冷液体。
[0023]前述参考文献的一个缺点是，通常地，稳定的和玻璃化生物材料被磨成粉，配制成片剂，或保持在容器如微量滴定板中的玻璃状薄膜中。已尝试了许多制备和使用玻璃状固定的生物材料的组合物的方法。一个系统利用玻璃状薄膜，其经干燥并分配到适用于最终用户的容器，如微量离心管中。然而，这个方法仅导致有限的成功。
[0024]因此，存在对在通过PCR扩增核酸之前从样品进行聚合酶链反应的改进的和简化的方法的需求。此外，存在对可在室温下储存、运输和重构而不需要在甘油中和较低温度下储存的PCR试剂混合物的需求。本专利技术致力于这些问题并提供可用以单一步骤扩增核酸的方法和试剂盒。
[0025]专利技术概述本专利技术提供可用于通过将所有需要的PCR试剂掺入到冻干形式中以容易扩增核酸样品而扩增核酸的方法和试剂盒。
[0026]根据本专利技术的第一方面，提供用于核酸扩增的干燥的试剂组合物，其包含掩蔽试剂、聚合酶和脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTP)。将掩蔽剂与聚合酶和dNTP掺入干燥的试剂组合物中的优点是减少核酸扩增所需步骤的数目，因此节省操作者时间并易于操作者使用。
[0027]在一个方面，核酸选自DNA、RNA和寡核苷酸。
[0028]术语“核酸”在本文使用时与术语“核苷酸”同义并包括DNA，如质粒DNA和基因组DNA；RNA，如mRNA、tRNA、sRNA和RNAi；和蛋白核酸、PNA。
[0029]在另一方面，掩蔽剂是环糊精。环糊精可选自α
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环糊精、β
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环糊精、γ
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环糊精及其衍生物。环糊精可由下列组成：6
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O
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α
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D
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麦芽糖基
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β环糊精、羟基乙基
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β
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环糊精、羟基丙基
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β
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环糊精和2...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种扩增核酸的方法，其包括以下步骤：i) 用冻干试剂组合物孵育含有核酸的溶液，所述组合物包含掩蔽试剂、聚合酶和脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTP)，其中所述掩蔽试剂为环糊精，和ii) 扩增所述核酸，其中所述核酸被固定在固体支持体上，并且其中溶胞试剂被包埋在所述固体支持体上；以及其中所述固体支持体是呈现预冲孔盘或FTA预冲孔盘的形式的基于纤维素的基质。2.权利要求1的核酸扩增方法，其中a)所述扩增方法是聚合酶链反应，或b)所述扩增方法包括逆转录聚合酶链反应或等温扩增。3.权利要求1或2的方法，其中所述扩增在单一反应容器中进行。...

【专利技术属性】
技术研发人员：JK霍尔顿，PJ塔特内尔，KL拉梅顿，
申请(专利权)人：通用电气医疗集团英国有限公司，
类型：发明
国别省市：