一种肠道内菌群鉴定分析方法技术

本发明专利技术公开了一种肠道内菌群鉴定分析方法，1)进行干粪便隐血检测，2)样品提取，3)样品质控，4)qPCR扩增，将质检合格的DNA样本稀释，然后分别构建qPCR反应体系，然后进行扩增；5)数据分析，灭菌水稀释DNA原液，进行上机通过软件，获得分析结果，本发明专利技术可以通过PCR反应获得多种种肠道细菌的相对含量信息，显著降低时间成本，体操筛查准确性。体操筛查准确性。体操筛查准确性。

【技术实现步骤摘要】
一种肠道内菌群鉴定分析方法


[0001]本专利技术涉及基因检测
，尤其涉及一种肠道内菌群鉴定分析方法。

技术介绍

[0002]近年来，肠道疾病发病率不断攀升，且肠道疾病早期症状不明显，缺乏有效的筛查方法，最终有可能发展成为癌症。现有技术对肠道疾病的检查和筛选主要通过粪便隐血实验初步筛查高危人群，再进行肠镜检查。然而粪便隐血实验缺乏特异性，初筛顺应性及高危人群的肠镜受检率仅30
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40％，疾病检出率19％左右，有待进一步提高。利用无创的标志物对人群进行筛查，可缩小肠镜检查人数，进一步提高肠镜的特异性及灵敏度，对早期筛查肠道疾病有重要的临床意义。
[0003]人的肠道内存在大量菌群，有益菌和条件致病菌共存，健康人的体内有益菌占优势，菌群数量维持平衡的稳态；但患有肠道疾病的人体内，体内环境发生变化，导致菌群失衡，条件致病菌数量显著增加，因此，通过鉴定肠道内菌群微生态可以对肠道疾病作出预警。

技术实现思路

[0004]本专利技术的提供一种肠道内菌群鉴定分析方法。
[0005]本专利技术的方案是：
[0006]一种肠道内菌群鉴定分析方法，包括下列步骤：
[0007]1)进行干粪便隐血检测，使用大便隐血检测试剂盒通过胶体金法进行检测，获得检测结果；
[0008]2)样品提取，取粪便样本装入管中，粪便样本中加入缓冲液GA，通过振荡或吹吸使粪便样本悬浮，然后加入20～30ul Proteinase K，混匀，加入缓冲液GB，振荡15s,70℃金属浴放置25～35min，同时震荡1000/min，溶液变清亮后离心，加入无水乙醇，充分振荡混匀15s，离心，沉淀絮状物，将管内溶液加入到吸附柱中，离心，吸附柱放入收集管中，然后向吸附柱加入缓冲液GD，离心，移除废液，漂洗处理，然后放入收集管中，离心，移除废液，室温放置3～6min，随后将吸附柱转入离心管中，箱吸附膜的中间部位悬空滴加洗脱缓冲液TE，65℃放置2～5min,离心2min，将其中溶液收集到离心管中，获得DNA样本；
[0009]3)样品质控，将步骤2)中所提取的DNA样本经分光光度计测试其浓度≥20ng/μl，经分光光度计测试OD260/OD280值为1.9
±
0.2，获得质检合格的DNA样本；
[0010]4)qPCR扩增，将质检合格的DNA样本稀释，然后分别构建qPCR反应体系，然后进行扩增；
[0011]5)数据分析，通过软件，获得分析结果。
[0012]作为优选的技术方案，所述反应体系如下：
[0013][0014]作为优选的技术方案，所述反应体系如下：
[0015][0016]作为优选的技术方案，所述反应体系如下：
[0017][0018]作为优选的技术方案，所述反应体系如下：
[0019][0020][0021]作为优选的技术方案，所述反应体系如下：
[0022]作为优选的技术方案，所述反应体系如下：
[0023]作为优选的技术方案，所述反应体系如下：
[0024]作为优选的技术方案，所述反应体系如下：
[0025][0026][0027]作为优选的技术方案，所述扩增反应条件：
[0028]循环参数，95℃,30s；95℃,5s至60℃,34s，循环32次；60℃检测荧光；溶解曲线，95℃，15s；60℃，1min至95℃，0.3℃/sec检测荧光；
[0029]荧光通道检测选择，检测为SYBR通道，根据结果判断标准判读结果。
[0030]由于采用了上述技术方案一种肠道内菌群鉴定分析方法，1)进行干粪便隐血检测，使用大便隐血检测试剂盒通过胶体金法进行检测，获得检测结果；2)样品提取，取粪便样本装入管中，粪便样本中加入缓冲液GA，通过振荡或吹吸使粪便样本悬浮，然后加入20～30ul Proteinase K，混匀，加入缓冲液GB，振荡15s,70℃金属浴放置25～35min，同时震荡1000/min，溶液变清亮后离心，加入无水乙醇，充分振荡混匀15s，离心，沉淀絮状物，将管内溶液加入到吸附柱中，离心，吸附柱放入收集管中，然后向吸附柱加入缓冲液GD，离心，移除废液，漂洗处理，然后放入收集管中，离心，移除废液，室温放置3～6min，随后将吸附柱转入离心管中，箱吸附膜的中间部位悬空滴加洗脱缓冲液TE，65℃放置2～5min,离心2min，将其中溶液收集到离心管中，获得DNA样本；3)样品质控，将步骤2)中所提取的DNA样本经分光光度计测试其浓度≥20ng/μl，经分光光度计测试OD260/OD280值为1.9
±
0.2，获得质检合格的DNA样本；4)qPCR扩增，将质检合格的DNA样本稀释，然后分别构建qPCR反应体系，然后进行扩增；5)数据分析，灭菌水稀释DNA原液，进行上机通过软件，获得分析结果。
[0031]本专利技术的优点：本专利技术便于操作使用，提高了检测的准确性；
[0032]有效鉴定多种种肠道细菌在肠道中的相对含量，进而鉴定肠道微生态的状况；
[0033]本专利技术通过大量筛选研究，确定多种特定细菌作为生物标志物，本专利技术的引物灵敏度高；
[0034]本专利技术可以通过PCR反应获得多种种肠道细菌的相对含量信息，显著降低时间成本，同时减少因操作人员加样过程引入的误差。
附图说明
[0035]图1为本专利技术实施例软件的选择程序类型界面图；
[0036]图2为本专利技术实施例软件的选择染料和扩增基因名称界面图；
[0037]图3为本专利技术实施例软件的设置对照基因界面图；
[0038]图4为本专利技术实施例软件的设置扩增程序界面图；
[0039]图5为本专利技术实施例软件的批次的结果界面图；
[0040]图6为本专利技术实施例的初步溶解曲线界面图；
[0041]图7为本专利技术实施例Excel文件设置界面图；
[0042]图8为本专利技术实施例修改Excel文件界面图；
[0043]图9为本专利技术实施例的最终熔解曲线；
[0044]图10为本专利技术的流程框架图。
具体实施方式
[0045]为了弥补以上不足，本专利技术提供了一种肠道内菌群鉴定分析方法以解决上述
技术介绍
中的问题。
[0046]一种肠道内菌群鉴定分析方法，包括下列步骤：
[0047]1)进行干粪便隐血检测，使用大便隐血检测试剂盒通过胶体金法进行检测，获得检测结果；
[0048]2)样品提取，取粪便样本装入管中，粪便样本中加入缓冲液GA，通过振荡或吹吸使粪便样本悬浮，然后加入20～30ul Proteinase K，混匀，加入缓冲液GB，振荡15s,70℃金属
浴放置25～35min，同时震荡1000/min，溶液变清亮后离心，加入无水乙醇，充分振荡混匀15s，离心，沉淀絮状物，将管内溶液加入到吸附柱中，离心，吸附柱放入收集管中，然后向吸附柱加入缓冲液GD，离心，移除废液，漂洗处理，然后放入收集管中，离心，移本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种肠道内菌群鉴定分析方法，其特征在于，包括下列步骤：1)进行干粪便隐血检测，使用大便隐血检测试剂盒通过胶体金法进行检测，获得检测结果；2)样品提取，取粪便样本装入管中，粪便样本中加入缓冲液GA，通过振荡或吹吸使粪便样本悬浮，然后加入20～30ulProteinase K，混匀，加入缓冲液GB，振荡15s,70℃金属浴放置25～35min，同时震荡1000/min，溶液变清亮后离心，加入无水乙醇，充分振荡混匀15s，离心，沉淀絮状物，将管内溶液加入到吸附柱中，离心，吸附柱放入收集管中，然后向吸附柱加入缓冲液GD，离心，移除废液，漂洗处理，然后放入收集管中，离心，移除废液，室温放置3～6min，随后将吸附柱转入离心管中，箱吸附膜的中间部位悬空滴加洗脱缓冲液TE，65℃放置2～5min,离心2min，将其中溶液收集到离心管中，获得DNA样本；3)样品质控，将步骤2)中所提取的DNA样本经分光光度计测试其浓度≥20ng/μl，经分光光度计测试OD260/OD280值为1.9
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0.2，获得质检合格的DNA样本；4)qPCR扩增，将质检合格的DNA样本使用灭菌水稀释到指定浓度，然后分别构建qPCR反应体系，然...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯明飞，朱月艳，孙子奎，
申请(专利权)人：上海派森诺医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：