用于检测叶酸代谢相关基因SNP的引物、荧光探针及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测叶酸代谢相关基因SNP的引物、荧光探针及应用。所提供的引物为四组，每组引物有对应的荧光探针组，分别针对rs1801133、rs1801131和rs1801394进行快速基因分型，应用本发明专利技术获得的检测结果精确可靠，且成本较低，具有较好的实用性。

Primers, fluorescent probes for detection of folate metabolism related gene SNP and their applications

The invention discloses a primer, a fluorescent probe and an application for detecting folate metabolism related gene SNP. The primers provided were four groups. Each primer had a corresponding fluorescent probe group, and the rapid genotyping was carried out against rs1801133, rs1801131 and rs1801394. The detection results obtained by this invention were accurate and reliable, and the cost was low, and it had good practicability.

【技术实现步骤摘要】
用于检测叶酸代谢相关基因SNP的引物、荧光探针及应用
本专利技术涉及生物
，具体地指一种用于检测叶酸代谢相关基因SNP的引物、荧光探针及应用。
技术介绍
叶酸(Folicacid)是维生素B复合体之一，相当于蝶酰谷氨酸(pteroylglutamicacid，PGA)，是米切尔(H.K.Mitchell，1941)从菠菜叶中提取纯化的，故而命名为叶酸。叶酸是机体所需的重要营养素，在绿叶蔬菜、水果及动物肝脏中含量丰富。叶酸在人体内以四氢叶酸的形式起作用，四氢叶酸是一碳单位的运载体，可运载甲基、甲烯基、甲醛基等一碳单位，参与体内氨基酸、嘌呤、嘧啶的合成。因而叶酸对细胞分裂增殖、组织修复和机体发育等都是不可缺少的营养素。叶酸对人体的重要营养作用早在1948年即已得到证实，人类(或其他动物)如缺乏叶酸可引起巨红细胞性贫血以及白细胞减少症。此外，研究还发现，叶酸对孕妇尤其重要，叶酸缺乏会导致两种结果：第一，使同型半胱氨酸向甲硫氨酸转化出现障碍，进而导致高同型半胱氨酸血症，后者可引起血管内皮损伤、促进血管平滑肌细胞增生，引起凝血和纤溶系统功能失调，使血液处于高凝状态，也是引起妊娠高血压综合征的重要因素；第二，引起S-腺苷甲硫氨酸/S-腺苷同型半胱氨酸比值降低，抑制DNA甲基转穆酶活性和DNA甲基化，造成染色体不分离现象，引起多种胎儿畸形。经研究，在出生缺陷前五名中，有四项与叶酸缺乏有关，即先天性心脏病、唇腭裂、脊柱裂和无脑儿。妊娠头4周是胎儿神经管分化和形成的重要时期，此期叶酸缺乏可增加胎儿神经管畸形及早产的风险；更有研究显示，妇女在服用叶酸4周后，体内叶酸缺乏的状态才能得到明显的改善。因此，育龄妇女至少应在孕前3个月开始，适当多吃富含叶酸的食物和补充叶酸，以确保胚胎早期有一个较好的叶酸营养状态，预防胎儿神经管及其他器官畸形的发生。育龄妇女服用叶酸增补剂时由于个人的遗传体质不同，存在叶酸代谢能力的差异，不同人群所需叶酸剂量不能一概而论。如服用剂量不足实际需求，达不到补充叶酸的效果；而盲目过量服用高浓度叶酸，会干扰孕妇的营养元素代谢，同样会影响胎儿发育，超量服用叶酸也会引起药品不良反应，反而会对孕妇和胎儿造成严重不良后果。所以不同身体状况与素质的育龄妇女必须根据自身情况，有的放矢地准备与补充所需要的叶酸。因此，选取与育龄妇女孕前/孕期以及胎儿发育所需的叶酸代谢密切相关且研究明确的一些重要基因位点，综合利用现代科学研究成果，开发一项基于分子遗传基础的叶酸增补剂服用定量指导产品，将能够针对不同遗传体质人群提出适合其自身需求的叶酸补充剂量指导，具有很强的社会意义和广阔的市场前景。目前检测叶酸代谢相关基因遗传多态性的最简单的方法是PCR-RFLP，其主要原理是通过应用特异性限制性内切酶消化PCR扩增产物，并根据消化位点是否消失来判断其变异存在与否。但该方法操作复杂，样本量多时易造成PCR产物的交叉污染且容易出现酶切不充分或酶切过度而出现假阴性或假阳性结果，可靠性低。多重PCR方法尽管特异性有所提高，但是这种方法的原理仍然是基于普通PCR的原理，引物特异性以及低保真Taq酶等这些因素均可造成对结果的影响。DNA测序法虽然是目前进行基因诊断的金标准，但步骤繁琐，过程复杂，试剂价格昂贵，容易出现样本间的交叉污染而导致测序失败；另外测序仪的装备也超出了一般临床检验实验室的承受范围。高分辨率熔解曲线法是一种快速，简便，经济，实用的分型方法，但基因分型依赖于仪器温度控制的精密性，假阳性高。Taqman探针的方法采用特异性的荧光标记的探针，特异性强，灵敏度高且操作方便，快速。该方法同样被认为是SNP分型的金标准，在临床应用的前景值得期待。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于检测叶酸代谢相关基因SNP的引物、荧光探针及应用。为实现上述目的，本专利技术提供的一组用于检测叶酸代谢相关基因SNP的第一引物：所述第一引物为如下引物对：677-F:CTGACCTGAAGCACTTGAAGGAGAA；677-R:GGGACGATGGGGCAAGTGA；由正向引物677-F:CTGACCTGAAGCACTTGAAGGAGAA或反向引物677-R:GGGACGATGGGGCAAGTGA的核苷酸序列经增加、缺失或替换单个核苷酸得到的引物；上述第一引物所对应的目的基因均为亚甲基四氢叶酸还原酶基因，以该基因为模板扩增所得DNA片段包含rs1801133[MTHFR(C677T)]位点。本专利技术还提供一组与第一引物配合使用的第一荧光探针，所述第一荧光探针包含如下两条：W677:FAM-ATGAAATCGGCTCCCGC-MGB；M677:VIC-ATGAAATCGACTCCCGC-MGB。本专利技术还提供上述第一引物和/或第一荧光探针在制备检测亚甲基四氢叶酸还原酶基因rs1801133[MTHFR(C677T)]多态性的试剂盒中的应用。为实现上述目的，本专利技术提供的用于检测叶酸代谢相关基因SNP的第二引物：所述第二引物为如下引物对：1298-F:TGAAGAGCAAGTCCCCCAAGG；1298-R:CCACTCCAGCATCACTCACTTTG；由正向引物1298-F:TGAAGAGCAAGTCCCCCAAGG或反向引物1298-R:CCACTCCAGCATCACTCACTTTG的核苷酸序列经增加、缺失或替换单个核苷酸得到的引物；上述第二引物所对应的目的基因均为亚甲基四氢叶酸还原酶基因，以该基因为模板扩增所得DNA片段包含rs1801131[MTHFR(A1298C)]位点。本专利技术还提供一组与第二引物配合使用的第二荧光探针，所述第二荧光探针包含如下两条：W1298:FAM-CAAAGACACTTTCTTCAC-MGB；M1298:VIC-CAAAGACACTTGCTTCAC-MGB。本专利技术还提供上述第二引物和/或第二荧光探针在制备检测亚甲基四氢叶酸还原酶基因rs1801131[MTHFR(A1298C)]多态性的试剂盒中的应用。为实现上述目的，本专利技术提供的用于检测叶酸代谢相关基因SNP的第三引物：所述第三引物为如下引物对：66-F:TTGAAGTGATGAGGAGGTTTCTGTT；66-R:GATCTGCAGAAAATCCATGTACCA；由正向引物66-F:TTGAAGTGATGAGGAGGTTTCTGTT或反向引物66-R:GATCTGCAGAAAATCCATGTACCA的核苷酸序列经增加、缺失或替换单个核苷酸得到的引物；上述第三引物所对应的目的基因均为甲硫氨酸合成酶还原酶，以该基因为模板扩增所得DNA片段包含rs1801394[MTRR(A66G)]位点。本专利技术还提供一组与第三引物配合使用的第三荧光探针，所述第三荧光探针包含如下两条：W66:FAM-CTCACATATTTCTTC-MGB；M66:VIC-CTCACACATTTCTT-MGB。本专利技术还提供上述第三引物和/或第三荧光探针在制备检测甲硫氨酸合成酶还原酶rs1801394[MTRR(A66G)]多态性的试剂盒中的应用。为实现上述目的，本专利技术提供的用于检测叶酸代谢相关基因SNP的引物组：所述引物组包括上述第一引物、第二引物及第三引物：所述第一引物为如下引物对：677-F:CTGACCT本文档来自技高网...

【技术保护点】
一组用于检测叶酸代谢相关基因SNP的第一引物：其特征在于，所述第一引物为如下引物对：677‑F:CTGACCTGAAGCACTTGAAGGAGAA；677‑R:GGGACGATGGGGCAAGTGA；由正向引物677‑F:CTGACCTGAAGCACTTGAAGGAGAA或反向引物677‑R:GGGACGATGGGGCAAGTGA的核苷酸序列经增加、缺失或替换单个核苷酸得到的引物；上述第一引物所对应的目的基因均为亚甲基四氢叶酸还原酶基因，以该基因为模板扩增所得DNA片段包含rs1801133[MTHFR(C677T)]位点。

【技术特征摘要】
1.一组用于检测叶酸代谢相关基因SNP的第一引物：其特征在于，所述第一引物为如下引物对：677-F:CTGACCTGAAGCACTTGAAGGAGAA；677-R:GGGACGATGGGGCAAGTGA；由正向引物677-F:CTGACCTGAAGCACTTGAAGGAGAA或反向引物677-R:GGGACGATGGGGCAAGTGA的核苷酸序列经增加、缺失或替换单个核苷酸得到的引物；上述第一引物所对应的目的基因均为亚甲基四氢叶酸还原酶基因，以该基因为模板扩增所得DNA片段包含rs1801133[MTHFR(C677T)]位点。2.一种与权利要求1所述的用于检测叶酸代谢相关基因SNP的第一引物配合使用的第一荧光探针，其特征在于，所述第一荧光探针包含如下两条：W677:FAM-ATGAAATCGGCTCCCGC-MGB；M677:VIC-ATGAAATCGACTCCCGC-MGB。3.权利要求1所述的第一引物和/或权利要求2所述第一荧光探针在制备检测亚甲基四氢叶酸还原酶基因rs1801133[MTHFR(C677T)]多态性的试剂盒中的应用。4.用于检测叶酸代谢相关基因SNP的第二引物：其特征在于，所述第二引物为如下引物对：1298-F:TGAAGAGCAAGTCCCCCAAGG；1298-R:CCACTCCAGCATCACTCACTTTG；由正向引物1298-F:TGAAGAGCAAGTCCCCCAAGG或反向引物1298-R:CCACTCCAGCATCACTCACTTTG的核苷酸序列经增加、缺失或替换单个核苷酸得到的引物；上述第二引物所对应的目的基因均为亚甲基四氢叶酸还原酶基因，以该基因为模板扩增所得DNA片段包含rs1801131[MTHFR(A1298C)]位点。5.一种与权利要求4所述用于检测叶酸代谢相关基因SNP的第二引物配合使用的第二荧光探针，其特征在于，所述第二荧光探针包含如下两条：W1298:FAM-CAAAGACACTTTCTTCAC-MGB；M1298:VIC-CAAAGACACTTGCTTCAC-MGB。6.权利要求4所述的第二引物和/或权利要求5所述第二荧光探针在制备检测亚甲基四氢叶酸还原酶基因rs1801131[MTHFR(A1298C)]多态性的试剂盒中的应用。7.用于检测叶酸代谢相关基因SNP的第三引物：其特征在于，所述第三引物为如下引物对：66-F:TTGAAGTGATGAGGAGGTTTCTGTT；66-R:GATCTGCAGAAAATCCATGTACCA；由正向引物66-F:TTGAAGTGATGAGGAGGTTTCTGTT或反向引...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪元涛，朱月艳，孙子奎，
申请(专利权)人：上海派森诺医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31