本发明专利技术涉及一种莱茵衣藻油脂代谢基因CrDGAT2-5及其编码蛋白与应用，所述莱茵衣藻油脂代谢基因CrDGAT2-5是以JGI莱茵衣藻基因数据库公布的au.g4218_t1基因为模板进行扩增cDNA获得，其序列如SEQ?ID?NO：1所示的核苷酸；其编码蛋白是根据其碱基序列分析而推测编码CrDGAT2-5蛋白质序列，其序列如SEQ?ID?NO：2所示的氨基酸残基序列的蛋白质；将该基因运用于莱茵衣藻进行植物表达可以显著提高莱茵衣藻中中性脂含量和生物量。本发明专利技术以JGI莱茵衣藻基因数据库公布的au.g4218_t1基因为模板进行扩增cDNA获得莱茵衣藻油脂代谢基因CrDGAT2-5，运用于莱茵衣藻中可以显著提高中性脂含量和生物量，对提高微藻含油量以及品质具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属微生物
，涉及一种能显著提高藻类中性脂含量的基因及其编码蛋白与应用，特别涉及一种能显著提高莱茵衣藻中性脂含量的莱茵衣藻油脂代谢基因 CrDGAT2-5及其编码蛋白与应用。
技术介绍
随着石油等化石燃料不可再生资源储量日益减少，全世界各国都在寻求可持续发展的新能源。目前化石燃料的替代能源主要形式是燃料乙醇和生物柴油。生物柴油由于具备来源广泛，成本低等优点，已经成为目前最有希望解决未来石油能源危机的可再生能源之一。目前，制备生物柴油的原料有餐饮废弃油、动物油脂、各种油料作物和微藻。餐饮废弃油来源有限；生产动物油脂成本高、周期长；植物油脂的生产又受到生产地域、季节周期等条件的制约，且大量种植油料作物用于生产生物柴油将会占用大量耕地和水资源同时将导致粮油作物价格上涨。微藻作为原料生产生物柴油具有极大的优势种类多，来源广泛、油脂成分可以直接生产生物柴油、吸收CO2有利于坏境改善、利用光能转化为化学能的效率高、油脂含量高、繁殖迅速、只需荒地，不会与粮食生产争水争地、培养简单易于大规模培养，因此以微藻为原料生产生物柴油已成为不可阻挡的趋势。用于生产生物柴油的理想的藻株要求具备生长迅速、含油量高且脂肪酸组成适宜制备生物柴油等特点。目前微藻有三种选育方式直接从种质库中筛选、人工诱变和利用生物基因工程与生物代谢工程人工制造工程藻株。前两种方法费时费力且随机性较强，第三种方法则最简单最直接，可以快速完善理想的工程藻株来满足各种生产需求。随着分子生物学的发展，从分子水平揭示微藻油脂，主要是中性脂三酰甘油(TAG)的合成和代谢机理， 改良藻种，控制微藻的代谢产物流向，已成为利用微藻制备生物柴油研究的重点。迄今，微藻TAG的合成和代谢分子机理研究还很薄弱，只有少量莱茵衣藻油脂体的分离以及油脂体中蛋白质分离的零星报道，对微藻中TAG的形成和积累网络途径相关基因的功能了解甚微。二酰基甘油酰基转移酶(Diacylgycerol acyltransferase, DGAT)是 TAG合成中的关键酶，作用是催化二酰甘油加上脂肪酸酰基形成三酰甘油。目前对高等植物的研究表明DGAT基因活性增强时可以提高9% -12%的油脂含量。DGAT有四种类型 DGAT1，DGAT2，WS/DGAT和细胞质内DGAT(Cytosolic DGAT)，在微藻中尚无DGAT基因家族的报道。对其它物种脂质合成途径和代谢过程研究表明对微藻的DGAT基因的深入研究对提高微藻含油量以及品质具有重要意义，尤其是近年来新兴的比较基因组学以及莱茵衣藻基因组测序的完成均为莱茵衣藻的TAG代谢途径相关候选基因的研究提供了可能性。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种能显著提高藻类中性脂含量和生物量的莱茵衣藻油脂代谢基因CrDGAT2-5及其编码蛋白与应用。本专利技术所提供的能提高藻类中性脂含量和生物量的莱茵衣藻油脂代谢基因 CrDGAT2~5 (Chlamydomonas reinhardtii Diacylgycerol acyltransferase2~5)是以 JGI 莱茵衣藻基因数据库公布的au. g4218_tl基因为模板设计特异性引物，扩增cDNA获得，其序列如SEQ ID NO :1所示的核苷酸，该基因来源于莱茵衣藻，在JGI莱茵衣藻基因数据库的名称为au. g4218_tl，位于12号染色体8831356-8833893区域，含7个外显子。对其研究发现该基因可以显著提高莱茵衣藻中中性脂含量和生物量。上述莱茵衣藻油脂代谢基因CrDGAT2_5，根据其碱基序列分析而推测编码 CrDGAT2-5 (Diacylgycerol acyltransferase2_5)蛋白质序列，其序列如 SEQ ID NO :2 所示的氨基酸残基序列的蛋白质，蛋白ID为285889，是由320个氨基酸残基组成的蛋白质。一种蛋白质，是将SEQ ID NO :2所示的蛋白质序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID NO :2所示的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID NO 2衍生的蛋白质。一种DNA序列，是将莱茵衣藻油脂代谢基因CrDGAT2-5经PCR扩增而得到，其序列如SEQ ID NO :3所示，与SEQ ID NO :1所示的核苷酸具有90%以上同源性且编码相同功能蛋白质的DNA序列。含有本专利技术基因的表达载体、细胞系及至少有15个核苷酸与由SEQ ID N0:1所示核苷酸序列或其互补链组成的DNA互补的DNA均属本专利技术的保护范围。采用任何一种引导外源基因在植物中表达的载体，将本专利技术所提供的莱茵衣藻油脂代谢基因CrDGAT2-5转入藻类导致中性脂含量和生物量增加，在微藻中将此基因敲除 (或沉默)后中性脂含量降低。如通过电转化法转化莱茵衣藻，得到纯合的CrDGAT2-5转化子(即为CrDGAT2-5过量表达的单拷贝纯合莱茵衣藻)。为了便于对转基因细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入了植物可选择性标记或具有抗性的抗生素标记物。用于转化的生物可以是细菌细胞，动物细胞和植物。一旦获得一种转化植物，其中已将本专利技术的DNA导入了基因组，就可能通过无性或有性繁殖获得后代，或者从该植株及其后代通过克隆获得繁殖材料来生产植物。用本专利技术DNA转化的植物细胞，包含这些细胞的植物体，该植物后代和克隆后代，以及所有从该植物获得的繁殖材料都属于本专利技术中。本专利技术的基因可以用于制备该基因的重组蛋白。重组蛋白常如下制备将编码本专利技术蛋白的DNA插入适当的表达载体，将该载体导入适当的细胞，培养转化的细胞，为使这些细胞表达所述重组蛋白和纯化所表达的蛋白。 重组蛋白可表达为与便于纯化的其他蛋白融合的蛋白，如与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合的蛋白。对宿主细胞没有限制，只要该细胞适于表达所述重组蛋白。所得重组蛋白可用于制备与该蛋白结合的抗体。例如用本专利技术的纯化重组蛋白或一部分免疫动物(如兔)，一段时间后采血，从而制备多克隆抗体。得到的抗体可用于检测或纯化本专利技术的蛋白和能与本专利技术蛋白互作的蛋白。相应的本专利技术包括能结合本专利技术蛋白的抗体。本专利技术以JGI莱茵衣藻基因数据库公布的au. g4218_tl基因序列为模板进行扩增 cDNA获得莱茵衣藻油脂代谢基因CrDGAT2-5，运用于莱茵衣藻中可以显著提高中性脂含量和生物量，对提高微藻含油量以及品质具有重要意义。附图说明图 1 为 CrDGAT2-5 的 RT-PCR 扩增结果。M :DL2000 DNA 分子量标准；1 :CrDGAT2_5扩增结果；图2为CrDGAT2_5过量表达转化子生物量的变化情况。图3为CrDGAT2_5过量表达转化子中性脂含量的变化情况。图4为原始藻株组、pCAMBIA1302空载体组、pCAMBIA1302_CrDGAT2_5转化组第六天时尼罗红染色后荧光观察图；图5CrDGAT2_5干涉藻株的生物量及中性脂含量变化图。A)六组转化子生物量的变化情况。B)六组转化子中性脂含量的变化情况。图6为Maa7/X^空载体转化子和CrDGAT2_5干涉藻株尼罗红染色后荧光观察图。图7CrDGAT2_5基因在莱茵衣藻CC425中的亚细胞定位。图8CrDGAT2_5基因在洋葱表皮细胞中的亚细胞定位。图本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种莱茵衣藻油脂代谢基因ＣｒＤＧＡＴ２－５，其特征是来源于莱茵衣藻，其序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所示的核苷酸。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：邓晓东，费小雯，辜博，罗秋兰，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院热带生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：66
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