一种莱茵衣藻目标基因敲除方法技术

本发明专利技术属生物工程技术领域，具体涉及一种莱茵衣藻目标基因敲除方法方法，包括pMCS-SPA-MCS载体和pTSBIR-XIR载体的构建。本发明专利技术通过筛选对候选基因有沉默效果的转化子，利用pMCS-SPA-MCS载体自身的酶切位点，通过构建pXF-SPA-XR载体来构建目标基因RNAi载体pTSBIR-XIR，从而实现对莱茵衣藻目标基因进行沉默，具有对目标基因敲除效率高、操作简便、快捷等特点。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
１．一种莱茵衣藻目标基因敲除方法方法，其特征在于：包括ｐＭＣＳ－ＳＰＡ－ＭＣＳ载体和ｐＴＳＢＩＲ－ＸＩＲ载体的构建；１）、中间载体ｐＭＤ２８５的构建以ＴＡＫＡＲＡ公司ｐＭＤ－１８Ｔ　Ｓｉｍｐｌｅ载体为基础，通过设计合成多克隆位点和间隔区序列，最后插入ｐＭＤ－１８Ｔ　Ｓｉｍｐｌｅ载体，得到中间载体ｐＭＤ２８５；Ａ、多克隆位点的设计选择实验室常用的ＴＡＫＡＲＡ公司生产的ｐＭＤ系列载体Ｔ克隆位点两端的常用内切酶位点作为间隔序列两端的酶切位点；Ｂ、间隔序列的选取以在转基因受体藻株中惰性为原则，选取ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２上的一段１８０ｂｐ在莱茵衣藻基因组中无同源性的一个片段作为间隔序列；Ｃ、两端带有多克隆位点间隔序列的合成将设计好的两端带有多克隆位点的间隔序列委托上海生工生物工程技术服务有限公司进行合成，所得序列如序列表（４００）１；同时，为两端带有多克隆位点的间隔序列设计一对引物：ＭＣＳＦ：５’－ＣＧＣＡＧＡＡＴＴＣＴＧＣＡＧＡＴＡＴＣ－３’ＭＣＳＲ：５’－ＧＧＴＣＧＡＡＴＴＣＣＡＧＣＡＣＡＣＴＧ－３’通过ＰＣＲ的方法将该序列克隆到ｐＭＤ－１８Ｔ　Ｓｉｍｐｌｅ载体上；Ｄ、克隆载体的选取选取ｐＭＤ－１８Ｔ　Ｓｉｍｐｌｅ作为克隆载体；Ｅ、两端带有多克隆位点的间隔序列插入ｐＭＤ－１８Ｔ　Ｓｉｍｐｌｅ利用引物ＭＣＳＦ：５’－ＣＧＣＡＧＡＡＴＴＣＴＧＣＡＧＡＴＡＴＣ－３’ＭＣＳＲ：５’－ＧＧＴＣＧＡＡＴＴＣＣＡＧＣＡＣＡＣＴＧ－３’进行ＰＣＲ扩增，回收ＰＣＲ产物并连接ｐＭＤ－１８Ｔ　Ｓｉｍｐｌｅ载体，连接产物转化ＤＨ５α细胞，提取质粒则得到ｐＭＤ２８５中间载体；２）、ＲＮＡｉ载体ｐＴＳＢＩＲ－ＸＩＲ的构建Ａ、克隆色莱茵衣藻色氨基酸合成酶β亚基基因３’端非编码区４５０ｂｐ的片段；通过引物ＴＢＳＦ：ＧＣＡＣＴＧＴＧＣＴＴＴＧＡＣＡＧＡＣＡＡＧ；ＴＢＳＲ：ＣＧＡＴＴＧＧＴＡＧＣＡＡＣＡＡＡＧＴＧＡＧＴＰＣＲ扩增得到ＴＢＳ基因反向重复序列，分别插入载体ＳＰ１２４Ｓ　Ｂｌｅ基因３’端非编码区区域，得到含ＴＢＳ反向重复序列的中间载体；Ｂ、以ＳａｃＩ／ＫｐｎＩ从ｐＳＩ１０３载体上将ａｐｈＶＩＩＩ　ｇｅｎｅ表达框切下，补平，连入步骤１得到的中间载体，得到ＲＮＡｉ载体ｐＴＳＢＩＲ－ＸＩＲ。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：邓晓东，费小雯，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院热带生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：66