基于CRISPR/Cas9技术的条件性基因敲除方法技术

本发明专利技术公开了一种用于基因敲除的引物，包括五组引物，分别如SEQNO:1和SEQNO:2、SEQNO:3和SEQNO:4、SEQNO:5和SEQNO:6、SEQNO:7和SEQNO:8、SEQNO:9和SEQNO:10所示。本发明专利技术还公开了所述的引物在基因敲除方面的应用。本发明专利技术还公开了基于CRISPR/Cas9技术的条件性基因敲除方法。本发明专利技术可进行条件特异性、时空特异性、药物诱导型基因修饰；减少对其他细胞的危害，研究组成型表达的基因在特定组织中的功能；只需Cas9工具鼠即可实现组织、空间特异性基因敲除或诱导型基因敲除；试验周期短，节省时间和成本。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因修饰
，具体涉及基于CRISPR/Cas9技术的条件性基因敲除方法。
技术介绍
随着科技的进步和对生命科学领域的不断探索，人们对活体内某一基因在特定组织、细胞及时间内的表达情况的研究显得更为迫切。近年来迅速发展的位点特异性重组技术是适应这种需要而产生的关键基因操作工具，其能够在一定发育阶段或在特定的组织中诱导靶基因失活，避免了靶基因缺失引起的胚胎早期死亡或出现复杂表型，删除筛选标记基因，从而对目的基因做出完整的功能分析。目前被广泛应用的重组酶系统有Cre-LoxP系统、FLP-FRT系统、R-RS系统以及I-SceI系统，但应用最多的还是Cre-LoxP系统。Cre-LoxP重组酶系统是条件性基因打靶、诱导性基因打靶、时空特异性基因打靶策略的核心技术。Cre-LoxP系统来源于P1噬菌体，包含以下两种成分：①一段34bp的DNA序列，含有两个13bp的反向重复序列和一个8bp的核心序列。这段34bp序列是重组酶的识别位点，被称为LoxP位点。②Cre重组酶，它是一种由343个氨基酸组成的单体蛋白，可以引发LoxP位点的DNA重组。任何序列的DNA，当其位于两个LoxP位点之间的时候，在Cre重组酶的作用下要么被缺失(两个LoxP位点的方向相同)，要么方向发生倒转(两个LoxP位点的方向相反)，如图1所示。利用Cre-LoxP系统实现体内某特定基因在特定条件下的敲除，需要两只转基因小鼠。第一只小鼠：首先在体外构建一个目的基因，其两端分别含有一个LoxP位点，之后将构建好的这段基因序列转入胚胎干细胞内。经过处理的胚胎干细胞被植入到假孕小鼠的子宫内，使其重新发育成为一个完整的胚胎，最终成为一只转基因小鼠。在这只转基因小鼠中，LoxP位点被引入到相应基因的内含子内，理论上不会对相应基因的功能产生影响，因此一般情况下，该小鼠的表型是正常的。第二只转基因小鼠：一般采用卵母细胞注射或者胚胎干细胞技术获得，在这只小鼠中，Cre重组酶被置于某特定基因启动子的调控之下，可以使其在某特定的条件下表达。最后，让这两只小鼠交配，产生的同时含有上述两种基因型的子代小鼠就会在某一特定类型的细胞中缺失某一特定的基因。人工核酸内切酶Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats,CRISPRs/Cas9系统，广泛存在于原核生物(大多数的细菌和所有的古细菌)基因组中。CRISPRs/Cas9系统自2002年首次被定义以来，一直以其独特的结构与特殊的功能引起各国科学家的共同关注。CRISPR大致分为3类，用于基因修饰的是II型CRISPR系统，其成分较为简单，只需要Cas9和两个非编码的RNA：crRNA与反式激活crRNA(tracrRNA)，三个组分即可介导外源DNA片段的靶向降解。在实际的操作过程中，我们只需要设计特异性的sgRNA，并与Cas9蛋白一起转入到小鼠的受精卵中即可。Cre-loxp重组酶系统虽然能够介导基因的条件性敲除，避免缺失功能基因造成的胚胎过早死亡等传统基因打靶技术的劣势，但还是存在很多不确定性：①哺乳动物基因组中存在隐含的/假的LoxP序列，其序列和LoxP的保守序列可能并不完全相同，但能够被Cre重组酶识别而发生重组，进而引起不必要的DNA损伤。②特异性差，很难得到存在双转基因的后代小鼠，成功率<50％。③鉴定筛选过程复杂、耗时长。现有的CRISPR/Cas9系统虽然操作简单，靶向精确性高，但不能实现组织、细胞、时空的特异性敲除。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术所要解决的第一个技术问题是提供了一种用于基因敲除的引物。本专利技术所要解决的第二个技术问题是提供了上述的引物在基因敲除方面的应用。本专利技术所要解决的第三个技术问题是提供了一种基于CRISPR/Cas9技术的条件性基因敲除方法。本研究的组织特异性敲除技术，是由第三代基因修饰技术CRISPR/Cas9与Cre-LoxP系统融合而来。其既有CRISPR/Cas9技术的优点，又能实现基因的组织特异性/药物诱导型基因敲除；另外又比Cre-LoxP技术的周期短、效率高，也减少了细胞毒性。本专利技术只需要设计特异性的sgRNA，即可实现基因的组织、时空的特异性修饰。利用Cas9工具鼠技术可以在短时间内高效、特异的研究组成型表达的基因在某一组织或特定的时间内的功能，为人类疾病的研究提供理论依据和动物模型。另外此专利技术也可作为临床和医药研究的配套技术，为人类的健康保驾护航。技术方案：为了解决上述问题，本专利技术的技术方案是提供了一组用于基因敲除的引物，包括以下五组引物，第一组引物序列如SEQ NO:1和SEQ NO:2所示，第二组引物序列如SEQ NO:3和SEQ NO:4所示，第三组引物序列如SEQ NO:5和SEQ NO:6所示，第四组引物序列如SEQ NO:7和SEQ NO:8所示，第五组引物序列如SEQ NO:9和SEQ NO:10所示。上述的引物在基因敲除方面的应用。一种基于CRISPR/Cas9技术的条件性基因敲除方法，包括以下步骤：1)表达载体的构建：构建组织特异性表达的sgRNA载体和组成型/药物诱导型表达的Cas9载体；2)表达载体测序正确后，分别电转到ES细胞中；通过PCR或Southern Blot验证，分别获得含有sgRNA表达质粒的ES细胞和含有Cas9蛋白的ES细胞并扩大培养；3)将含有Cre重组酶的质粒转化到含有Cas9蛋白的ES细胞中，获得没有筛选标记的Cas9表达载体的ES细胞；4)将含有Cas9表达载体的ES细胞与含有sgRNA表达质粒的ES细胞分别注射到囊胚中；5)将囊胚分别移植到代孕母鼠中，进行饲养；生产出的后代即为F0代组织特异性表达的sgRNA小鼠和组成型/药物诱导型的Cas9工具鼠；6)将检测正确的Cas9工具鼠与sgRNA小鼠杂交，获得组织特异性/药物诱导型基因敲除小鼠。其中，上述组织特异性表达的sgRNA载体包括组织特异性表达的启动子、Cre重组酶、反向的2个LoxP位点和反向的U6启动子，使其只能在特定组织内表达Cre酶，引导LoxP位点间的U6启动子倒位，从而启动sgRNA的表达，如图2所示。其中，上述组织特异性表达的sgRNA载体包括组织特异性表达的启动子、Cre重组酶、正向的U6启动子、方向相同的2个LoxP位点和终止区域，使其只有在特定组织内表达本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于基因敲除的引物，其特征在于，包括以下五组引物，第一组引物序列如SEQ NO:1和SEQ NO:2所示，第二组引物序列如SEQ NO:3和SEQ NO:4所示，第三组引物序列如SEQ NO:5和SEQ NO:6所示，第四组引物序列如SEQ NO:7和SEQ NO:8所示，第五组引物序列如SEQ NO:9和SEQ NO:10所示。

【技术特征摘要】
1.一种用于基因敲除的引物，其特征在于，包括以下五组引物，第一组引物序列
如SEQ NO:1和SEQ NO:2所示，第二组引物序列如SEQ NO:3和SEQ NO:4所
示，第三组引物序列如SEQ NO:5和SEQ NO:6所示，第四组引物序列如SEQ 
NO:7和SEQ NO:8所示，第五组引物序列如SEQ NO:9和SEQ NO:10所示。
2.权利要求1所述的引物在基因敲除方面的应用。
3.一种基于CRISPR/Cas9技术的条件性基因敲除方法，其特征在于，包括以下步
骤：
1)表达载体的构建：构建组织特异性表达的sgRNA载体和组成型/药物诱导型表达的
Cas9载体；
2)表达载体测序正确后，分别电转到ES细胞中；通过PCR或Southern Blot验证，分
别获得含有sgRNA表达质粒的ES细胞和含有Cas9蛋白的ES细胞并扩大培养；
3)将含有Cre重组酶的质粒转化到含有Cas9蛋白的ES细胞中，获得没有筛选标记的
Cas9表达载体的ES细胞；
4)将含有Cas9表达载体的ES细胞与含有sgRNA表达质粒的ES细胞分别注射到囊胚
中；
5)将囊胚分别移植到代孕母鼠中，进行饲养；生产出的后代即为F0代组织特异性表达
的sgRNA小鼠和组成型/药物诱导型的Cas9工具鼠；
6)将检测正确的Cas9工具鼠与sgRNA小鼠杂交，获得组织特异性/药物诱导型基因敲
除小鼠。
4.根据权利要求3所述的基因敲除方法，其特征在于，所述组织特异性表达的
sgRNA载体包括组织特异性表达的启动子、Cre重组酶、反向的2个LoxP位点和反向
的U6启动子。
5.根据权利要求3所述的基因敲除方法，其特征在于，所述组织特异性表达的
sgRNA载体包括组织特异性表达的启动子、Cre重组酶、正向的U6启动子、方向相同
的2个LoxP位点和终止区域。
6.根据权利要求3所述的基因敲除方法，其特征在于，所述F0代组织特异性表达
sgRNA小鼠的构建方法如下：
21)sgRNA片段设计与合成：
22)将步骤21)合成的sgRNA片段退火为双链片段；
23)将双链片段连接到线性化载体Church Cloning Vector或pCR-Blunt II-TOPO中
得到连接产物sgRNA表达质粒；
24)将连接产物sgRNA表达质粒转化、挑选阳性克隆，进行菌落PCR验证；
25)将菌落PCR得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；
26)将验证正确的克隆进行测序得到测序正确的...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑敦武，营婷，姜莎莎，俞晓峰，欧阳应斌，徐文静，黎妃凤，朱道云，王正龙，
申请(专利权)人：赛业苏州生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32